肝纤维化是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时,肝脏中胶原蛋白等细胞外基质的增生与降解失去平衡,导致肝脏内纤维结缔组织异常沉积的病理过程,它是一种可逆性病变。目前认为,肝星状细胞激活、增殖并大量生成(extracellular matrix, ECM)的过程是肝纤维化病理机制的中心环节,肝星状细胞(hepatic Stellate cell,HSC)的激活和增殖受多种细胞因子的调控。因此,阻断细胞因子的促增殖作用,有望成为肝纤维化治疗的有效手段。近几年来中医药抗肝纤维化治疗研究取得较大进展。前期在国家自然科学基金的资助下(N0:30760321)证实白花丹具有抗肝纤维化作用,白花丹的主要抗肝纤维化药物活性成分是白花丹醌,白花丹醌具有很强的活血化瘀作用。瘦素(leptin)是新发现的促肝纤维化的细胞因子,最近研究显示,leptin具有诱导HSC活化和增殖作用。目的:本课题将以人HSC为对象,从细胞和分子水平深入开展白花丹醌对外源性leptin刺激后HSC之生物学特性和细胞内信号分子活化方面的研究,主要从抑制HSC激活、增殖、分泌、凋亡及胶原合成等几方面集中探究白花丹醌减少(抑制)HSC-LX2分泌胶原蛋白的靶位点和可能的作用分子机制,为开发广西特色民族药材抗肝纤维化提供理论和实验依据。方法:1. MTT法检测白花丹醌对HSC-LX2和人胚肝细胞(L-O2)毒性的影响以及leptin与HSC-LX2作用的时间和浓度的选择。2. ELISA法检测HSC-LX2细胞培养上清液中leptin的分泌;检测白花丹醌对HSC-LX2细胞培养上清液TGF-β1,α-SMA, TNF-α, PDGF-BB, I型胶原表达的影响。3.流式细胞术检测肝星状细胞细胞周期分布及细胞凋亡的变化。4透射电镜观察肝星状细胞凋亡超微结构。5.免疫细胞化学法检测HSC-LX2凋亡相关蛋白p53, Bax, Bcl-2的表达。6.实时荧光定量PCR法检测白花丹醌对HSC-LX2 TGF-β1、α-SMA等细胞因子表达。7. Western blot法检测白花丹醌对HSC-LX2细胞周期相关蛋白p53、Bax、Bcl-2;细胞因子TGF-β1,α-SMA, TNF-α, PDGF-BB;leptin刺激HSC-LX2信号转导通路相关蛋白OB-Rb, JAK2, STAT3, ERK1/2等蛋白表达的影响。结果:1.白花丹醌对HSC-LX2 IC50值平均为5.016μg/ml,对人正常胚肝细胞L-O2 IC50值为18.852μg/ml。白花丹醌对HSC-LX2毒性选择指数(SI)为3.76,说明白花丹醌对HSC-LX2具有一定的选择性毒性作用。2.给药12 h、24 h后,与空白对照组比较,白花丹醌低、中剂量组细胞上清液SOD、MDA、LDH含量均无显著性差异(P>0.05),白花丹醌高剂量组与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05),给药48 h后白花丹醌高剂量组与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。实验结果表明白花丹醌对人肝细胞L-O2有一定的毒性作用,且药物浓度越高,作用的时间越长,毒性越大。考虑到白花丹醌的毒性作用,在后续实验选择白花丹醌2μmol/L、8μmol/L作为实验浓度。1. HSC自分泌leptin的浓度随着培养时间的延长而递减,24 h达到最低,48 h又上升到原来水平,每个时间点分泌的leptin浓度比较无显著性差异(P>0.05),说明HSC自分泌leptin的量变化仍不明确。2.流式细胞术PI染色法检测各周期细胞的DNA含量,结果显示,白花丹醌作用HSC-LX2 24 h后,HSC-LX2细胞G0/G1期细胞的百分比均明显增高,而S期+G2/M期细胞总数的百分比明显降低;并且随着药物剂量的增加,G0/G1期细胞的百分比增高,而S期+G2/M期细胞总数的百分比降低,呈剂量依赖性。白花丹醌阻断HSC细胞由G0/G1期向S期、G2/M期转变,从而抑制细胞DNA合成,抑制细胞分裂,使细胞周期进程减缓,阻止其发生增殖。3.与空白对照组比较,leptin刺激显著增加了HSC-LX2细胞周期蛋白Cyclin DI、Cyclin E的含量,阻断了抑制蛋白p21的表达;白花丹醌则明显降低了Cyclin Dl、Cyclin E蛋白水平,增加了p21的蛋白表达。4.细胞流式术结果显示,白花丹醌作用HSC-LX2 24 h,HSC-LX2凋亡率明显增加,白花丹醌2, 8μmol/L组和秋水仙碱组HSC凋亡率分别为(3.07±0.30)%,(5.21±0.41)%,(10.1±1.08)%,均显著高于空白对照组(1.40±0.13)%(P<0.01)。表明白花丹醌对HSC-LX2有一定的促凋亡和致坏死的作用。5.电镜结果显示,空白对照组细胞形态清晰,细胞膜、核膜完整,细胞表面有大量微绒毛。白花丹醌组可见少量坏死细胞和许多不同程度的凋亡细胞。阳性对照组可见少量坏死细胞和许多不同程度的凋亡细胞,其细胞体积变小,核膜消失,胞质浓缩,胞质内出现大量空泡,染色质边集,核固缩。6.受leptin刺激后HSC-LX2胞浆内表达少量的bax, Bcl-2, p53,可见少量的棕黄色颗粒,经白花丹醌2.8μmol/L干预后, HSC-LX2促凋亡基因Bax, p53蛋白表达明显升高,抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达显著降低,与leptin对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.01)。1. ELISA法检测细胞上清液中细胞因子分泌情况,结果显示,与空白对照组比较,leptin组HSC培养上清液中TGF-β1、α-SMA、TNF-α、PDGF-BB含量显著增加(P<0.01)。与leptin组比较,白花丹醌各药物浓度组上清液中TGF-β1、α-SMA、TNF-α、PDGF-BB的含量明显降低(P<0.05或P<0.01),且随着白花丹醌作用浓度增加,对TGF-β1、α-SMA、TNF-α、PDGF-BB的活性抑制越显著。2.用2-△△CT方法的公式进行计算,得到相对于leptin对照组的TGF-β1、α-SMA、TNF-α、PDGF-BB mRNA相对表达量。荧光实时定量PCR反应结果显示:空白对照组HSC有一定量TGF-β1、α-SMA、TNF-α、PDGF-BB mRNA表达,白花丹醌和秋水仙碱作用24 h后,活化的HSC-LX2内TGF-β1、α-SMA、TNF-α、PDGF-BBmRNA含量较leptin对照组均明显下降(P<0.05或P<0.01)。3. Western blot结果显示,leptin与HSC-LX2孵育24 h,可刺激的HSC-LX2 TGF-β1、α-SMA、PDGF-BB蛋白表达明显升高,轻微增加TNF-α蛋白的表达,白花丹醌与HSC-LX2孵育24 h后,明显减少HSC-LX2TGF-β1、α-SMA、PDGF-BB蛋白表达,对TNF-α表达无明显影响。1.以最佳刺激浓度(100 ng/ml)的leptin作用于HSC-LX2,检测不同时间点OB-Rb的表达水平。结果显示,leptin(100 ng/ml)可诱导HSCOB-Rb的表达,并呈现一定的时相变化。leptin刺激HSC 6 h后,即见OB-Rb表达增强,但无统计学意义;24 h时达到高峰(P<0.01); 36 h时仍保持较高的活化状态P<0.01);48 h后则基本接近初始水平。2. Western blot法研究白花丹醌对leptin刺激HSC-LX2后蛋白酪氨酸激酶(JAK)-信号转导子和转录激活子(STAT)信号转导通路中相关信号因子:OB-Rb、JAK2、STAT3、ERK1/2及其磷酸化蛋白、MMP-1、MMP-13的影响。①leptin刺激显著地增加了OB-Rb受体蛋白的表达,白花丹醌处理则明显地降低了OB-Rb受体蛋白的表达。②与空白对照组比较,leptin刺激显著地增加了JAK2、pJAK2蛋白的表达。与leptin对照组比较,白花丹醌处理则明显地降低了pJAK2蛋白的表达水平(P<0.01),但对JAK2蛋白表达无明显影响(P>0.05)。③与空白对照组相比较,leptin刺激更加显著地增加了STAT3、pSTAT3受体蛋白表达水平(P<0.01)。白花丹醌处理则明显地降低了STAT3、pSTAT3受体蛋白的表达(P<0.05)。④与空白对照组相比较,leptin刺激更加显著地增加了ERK1/2、pERK1/2蛋白的丰度(P<0.01或P<0.05)。白花丹醌处理则明显地降低了ERK1/2、pERK1/2蛋白的表达(P<0.01或P<0.05)。⑤与空白对照组比较,leptin刺激可明显降低HSC-LX2 MMP-1的表达,MMP-13表达水平无显著变化(P>0.05)。白花丹醌作用HSC-LX224h后MMP-l蛋白表达水平升高,MMP-13无显著变化(P>0.05)。⑥.与空白对照组比较,leptin(100 ng/ml)可刺激HSC-LX2 I型胶原的增生和表达显著增加,白花丹醌处理组可明显抑制HSC胞内I胶原的表达和分泌。3. ELISA检测白花丹醌对leptin刺激HSC-LX2I型胶原表达。结果显示:与空白对照组比较,leptin对照组HSC培养上清液中I型胶原的含量显著增加(P<0.01),与leptin对照组比较,白花丹醌各药物浓度组上清液中I型胶原的含量明显降低,差异有显著性(P<0.05)。结论:1.白花丹醌对正常人肝细胞L-O2具有一定的毒性作用,且药物浓度越高,作用时间越长,毒性越大。该药对HSC-LX2的毒性作用具有一定的选择性。2.外源性leptin可促进HSC增殖和活化,并呈现剂量、时间依赖性。3.白花丹醌可通过阻止HSC-LX2由G0/G1期进入S期,而抑制leptin所致的细胞增殖,其作用机制可能是与其降低cyclin D1、cyclin E1蛋白表达,提高P21蛋白表达有关。4.白花丹醌对HSC-LX2有一定的促凋亡和致坏死的作用。白花丹醌诱导HSC凋亡具体机制在于上调活化的HSC中p53、bax蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达。5.白花丹醌从基因和蛋白水平抑制外源性leptin刺激HSC-LX2的TGF-β1、α-SMA、PDGF-BB分泌,从基因水平抑制TNF-α的表达。6.白花丹醌从细胞膜受体水平抑制外源性leptin刺激HSC的增殖,降低HSC-LX2OB-Rb蛋白的表达。7.白花丹醌可通过阻断HSC-LX2细胞内JAK2-STAT3信号通路,降低JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平,从而抑制外源性leptin刺激的HSC-LX2增殖。8.白花丹醌阻断leptin诱导MAPK信号转导途径相关因子ERK蛋白磷酸化,在HSC的MAPK信号转导途径上显著抑制HSC的增殖。9.白花丹醌抑制leptin诱导I型胶原、MMP-1的表达。