先天性膈疝(Congenital Diaphragmatic Hernia，CDH)是一种由于单侧或双侧膈组织发育异常，导致腹腔脏器疝入胸腔，从而产生一系列病理变化的先天性疾病，其发病率约为1/2000-1/5000。CDH发现时间多为孕20周-30周，根据膈疝发生部位分为左侧膈疝和右侧膈疝;根据是否伴有肝脏疝入胸腔分为重度膈疝（伴有肝脏疝入）和普通膈疝;根据其是否伴有其他畸形，先天性膈疝又可分为单纯的CDH及复杂CDH，复杂的CDH患者可伴有心脏、肾脏、脑和其他脏器的结构异常，此类患者常伴随染色体的异常。CDH患儿多存在肺发育不良以及出生后持续性肺动脉高压。尽管近年产前诊断技术及外科手术水平快速发展，对先天性膈疝的认识及治疗水平有所提高，但其病死率仍居高不下，高达40％-60％。由于膈疝的致病原因不明确，目前尚无有效的干预手段，治疗仍以产后择期手术关闭膈肌为主，因此探寻其致病原因对控制其发病率、早期诊断和早期干预、缓解家庭和社会负担具有重要意义。　　CDH是一种复杂的多基因、多遗传模式疾病。国际上对于CDH的病因研究表明遗传因素在CDH患儿中起着非常重要的作用。目前，文献报道与先天性膈疝相关的基因共75个，分布于44个基因家族。而中国先天性膈疝患儿的基因筛查研究起步较晚，报道较少。本研究通过对中国单纯先天性膈疝患儿脐血样本进行全外显子测序(Whole-exome sequencing，WES)，筛查中国先天性膈疝患儿的基因变异情况，以发现与先天性膈疝致病相关的基因变异和涉及的信号通路。另外，通过对除草醚诱导的先天性膈疝小鼠模型的研究，探讨相关信号通路在膈疝发生中的作用机制。　　Shh-Gli信号通路是一条调节胚胎发育的经典信号通路，在胚胎发育过程中起到重要作用。Shh蛋白通过与膜表面受体Ptch结合，启动下游靶基因Gli的转录和表达。Kif7作为近期发现的一个Hh信号通路的负调节因子，定位于纤毛，与相应配体结合抑制Shh-Gli信号通路。Disp1是一种协助Shh分泌的膜蛋白，是协助Shh信号旁分泌及远程调控的重要因子。Gli从属于Zinc fingers C2H2-type基因家族，通过对24例单纯CDH患者行WES测序分析提示该基因家族的变异与CDH相关性极高。虽然Shh-Gli信号通路在很多组织发育的过程中起到重要作用，但Shh-Gli信号通路是否参与膈疝形成目前仍不清楚。　　目的:　　通过WES技术筛查发现可能与单纯CDH发病相关基因并探讨Shh-Gli信号通路在膈疝发生中的机制。　　方法:　　1、选取自2013年6月至2015年8月期间中国医科大学附属盛京医院收治先天性膈疝患儿24例，取胎儿脐带血作为全外显子测序检测对象。通过基因组外显子测序，发现可能与CDH相关的突变基因。对差异表达基因进行生物信息学分析，采用在线工具STRING分析候选基因之间的蛋白质互作网络。采用在线工具Phenolyzer寻找与表型相关的基因以及与之存在相互作用的突变基因，并通过查询KEGG等相关数据库进行通路分析，得出可能与先天性膈疝发病机制相关的基因及信号通路，通过文献挖掘，对可能与先天性膈疝发生的生物学过程关系密切的基因及信号通路进行分析，初步探讨相关的基因及信号通路。经Phenolyzer对筛查出的基因进行排序及STRING分析得出，Zinc fingers C2H2-type基因家族中Gli基因与CDH关系度最高，Shh-Gli信号通路最有可能在先天性膈疝的发生中起到重要作用。　　2、构建除草醚诱导先天性膈疝大鼠模型检测Shh-Gli信号通路作用元件在膈发育过程中表达变化。　　CDH大鼠模型的建立:取成年SPF级SD雌性大鼠将其编号后根据随机数字表法分为对照组和CDH组，将雄性和雌性SD大鼠按1∶2比例合笼过夜，于次日晨在光学显微镜下观察雌性大鼠阴道涂片，镜下见到精子者视为妊娠，当天上午则定为妊娠第0.5天。在妊娠第9.5天，给予先天性膈疝(CDH)组大鼠除草醚100mg（溶于1ml橄榄油中，溶液浓度100mg/ml）灌胃，对照组大鼠则灌入1ml橄榄油。分别于妊娠第13.5天（膈发育初期，原始膈）、15.5天（膈发育期）、18.5天（成熟膈组织），两组孕鼠在全身麻醉下行剖宫取胎，解剖胎鼠，留取胎鼠膈组织。　　通过HE染色观察CDH膈发育各时期（原始膈、发育中的膈及成熟膈）结构变化情况。　　通过免疫组化方法计数细胞周期标记蛋白Ccnd1核阳性表达细胞占膈总细胞比例判断CDH组膈细胞增殖变化。　　通过定量PCR、免疫组化及Western-blot观察各发育阶段膈组织变化及Shh-Gli信号通路作用元件Shh，膜受体Ptch1、负调节因子Kif7、Disp1因子、下游基因Gli(Gli1、Gli2、Gli3)在膈发育过程中表达差异。　　3、通过培养原代膈间质细胞，外源性给予Shh刺激模拟Shh信号通路过度激活，通过定量PCR及Western-blot检测下游因子Gli1及细胞周期标记因子Ccnd1的表达。　　结果:　　1、对24例膈疝样本采用全外显子测序分析找到27个共有基因家族，涉及1986个基因。其中已知与先天性膈疝相关的有10个基因家族，17个基因家族为新发现与先天性膈疝相关的基因家族。通过在线软件Phenolyzer对基因进行排序后，Zinc fingers C2H2-type基因家族所含基因排名最靠前。通过String分析，发现Sonic Hedgehog信号通路、钙离子信号通路、WNT信号通路、Notch信号通路、胰岛素信号通路、mTOR信号通路、MAPK信号通路和VEGF信号通路等可能与先天性膈疝的发生相关。因Zinc fingers C2H2-type基因家族与CDH相关性最高，其基因家族中Gli基因存在与Shh-Gli信号通路，我们选择Shh-Gli信号通路进行验证。　　2、在先天性膈疝大鼠模型中，妊娠13.5天胎鼠胸腹皱褶(pleuroperitoneal fold，PPF)失去正常三角形结构，妊娠15.5天发育中的膈组织，以及妊娠18.5天发育成熟的膈组织中均发现细胞数目增多及增殖增加的现象。　　3、通过免疫组化提示Kif7与Disp1定位于细胞浆中，在膈组织中有表达，与对照组相比CDH组膈组织中负调节因子Kif7与因子Disp1的mRNA及蛋白表达均降低，P＜0.05。Gli1位于细胞核中，在膈组织中均高表达，与对照组相比CDH组膈组织中Gli1的mRNA及蛋白表达明显升高，P＜0.05。Gli2、Gli3在转录水平及表达水平改变在统计学上无意义。Shh与Ptch在膈组织中肌肉细胞及非肌肉的间质细胞无表达。　　4、给予原代膈间质细胞外源性Shh刺激可以增加Gli1与Ccnd1的表达，可促进原代膈间质细胞增殖。　　结论:　　1、对我国24例先天性膈疝患儿全外显子测序发现27个基因家族，1986个基因与先天性膈疝相关，为该疾病的产前诊断提供基础。　　2、Shh-Gli1信号通路参与大鼠先天性膈疝的发生，是先天性膈疝发病的原因之一。