多药耐药(multidrug resistance，MDR)是小儿白血病治疗失败、疾病复发的一个重要原因之一。其产生是多因素、多机制综合作用的结果。关于多药耐药的研究，既往大多着眼于肿瘤细胞本身的生物异质性，而往往忽略了宿主因素，尤其是细胞所处的造血微环境的作用。近年来的研究发现，造血微环境提供了细胞生存、增殖的土壤，细胞外基质及其分泌的多种细胞因子的作用日益受到重视。造血微环境可形成内稳态，通过多种途径影响着血液肿瘤细胞的生物学特性，包括耐药表型。深入研究造血微环境，将为多药耐药和微小残留病变的治疗提供新的靶点。针对造血微环境所表达的特殊蛋白的治疗，对正常组织的影响小，同时对于转移灶和微小残留病变的针对性强，有望成为克服难治性血液肿瘤多药耐药的一种有效途径。 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种具有肝素结合活性的生长因子，通过自分泌和旁分泌的方式作用于白血病细胞和微环境中的基质细胞，不仅在血管生成中起调节作用，而且在细胞的增殖过程中发挥了重要作用。一方面，VEGF以旁分泌的形式调节白血病的血管生成，还通过血管内皮细胞分泌途径产生G-CSF、GM-CSF、IL-6和SCF促进白血病细胞的增殖。另一方面，白血病细胞分泌的VEGF作用于本身，维持自身存活、增殖、阻止白血病细胞凋亡，增强白血病细胞对放化疗的抵抗作用，并引起细胞迁移。 目前，以VEGF及其受体为靶点的研究中，反义核酸是一种较有前景的方法。它不仅直接特异的封闭基因表达，而且少有毒副作用。因此本研究选择白血病细胞VEGF自分泌和旁分泌环的共同上游，阻断VEGF的自身分泌，观察白血病和耐药白血病细胞的生物学行为(细胞增殖，细胞凋亡，相关基因表达，耐药白血病细胞的致瘤性)的改变。探讨VEGF在逆转白血病耐药中发挥的作用及机制，为临床耐药白血病的治疗提供一条新的选择途径。 研究内容： 1.建立VEGF反义核酸真核表达体系，为VEGF反义核酸的体内和体外研究建立方法学基础。 2.研究VEGF反义核酸对白血病细胞和耐药白血病细胞生长的影响。 3.研究VEGF反义核酸对耐药白血病细胞对化疗药物敏感性的影响。 4.建立白血病多药耐药动物模型。 5.研究VEGF瘤体原位注射及与化疗药物联合应用对荷瘤鼠生存的影响。 研究方法： 1.构建VEGF反义核酸真核表达载体从K562细胞中抽提RNA，RT-PCR方法扩增VEGF121片段，双酶切空白质粒载体pcDNA3-3.1和VEGF121片段后，利用设计好的酶切位点将VEGF121片段反向插入质粒pcDNA3-3.1，得到VEGF反义核酸表达质粒AS-pcDNA3-3.1-VEGF，筛选并鉴定阳性质粒，扩增质粒。 2.VEGF反义核酸对白血病细胞生长的影响通过脂质体转染技术将VEGF反义核酸真核表达载体AS-pcDNA3-3.1-VEGF转染到HL60和HL60/VCR细胞，观察不同细胞生长抑制情况，ELISA方法检测培养细胞VEGF表达，RT-PCR方法检测耐药相关基因表达，流式细胞术检测细胞周期变化，WESTERNBLOT检测P-gp蛋白表达。 3.VEGF反义核酸联合化疗药物对耐药白血病细胞的影响采用脂质体转染技术将VEGF反义核酸载体AS-pcDNA3-3.1-VEGF转染耐药细胞HL60/VCR，分别加入HT或DNR，观察HL60/VCR对HT或DNR耐药性的变化，ELISA方法检测培养细胞VEGF表达，RT-PCR方法检测耐药相关基因表达，流式细胞术检测凋亡情况。 4.建立多药耐药荷瘤鼠模型将HL60/VCR皮下接种BALB/c-nu/nu裸鼠，观察肿瘤生长及转移情况，建立多药耐药荷瘤鼠模型。 5.VEGF反义核酸治疗耐药白血病的研究将荷瘤鼠分为3组，VCR组，VCR+AS-pcDNA3-3.1-VEGF组，对照组。将AS-pcDNA3-3.1-VEGF肿瘤原位注射与VCR腹腔注射后，观察各组裸鼠的生存情况，外周血数量和细胞形态学改变，病理切片观察不同部位的肿瘤负荷，RT-PCR方法检测不同部位肿瘤组织VEGF、MDR1表达改变。 研究结果： 1.VEGF121扩增片段长度421bp，双酶切和测序结果均证实质粒AS-pcDNA3-3.1-VEGF含有反向插入的VEGF121。 2.1.25umol/mL AS-pcDNA3-3.1-VEGF 与脂质体质量比为3：1转染HL60/VCR细胞72h时，转染效率最高，荧光细胞达51±2.4％。 3.AS-pcDNA3-3.1-VEGF作用于HL60、HL60/VCR细胞24h和48h后，HL60/VCR细胞VEGF表达量明显高于HL60细胞。与对照组比较，转染组VEGF表达量显著降低(P＜0.05)。Bcl-2、Mcl-1和TopoⅡα在HL60和HL60/VCR细胞中表达量无明显差异(P＞0.05)，而MDR1、MRP、GSTπ、ToPo Ⅱβ的表达量在HL60/VCR细胞组明显高于HL60细胞组(P＜0.01)。HL60细胞几乎不表达P-gP，HL60/VCR细胞P-gp表达量24h明显高于48h(P＜0.05)。各组细胞均未出现凋亡现象。 4.AS-pcDNA3-3.1-VEGF与HT或DNR联合应用能有效抑制HL60/VCR细胞存活，与对照组相比，IC50有显著性差异(P＜0.01)，VEGF表达量显著降低(P＜0.05)。Bcl-2、Mcl-1、TopoⅡα、MDR1、MRP、GSTπ、ToPoⅡβ表达量均显著降低(P＜0.05)，P-gP表达量也显著降低(P＜0.05)。与对照组比较，各组细胞均出现凋亡现象，S-pcDNA3-3.1-VEGF+化疗药物组凋亡细胞显著增多(P＜0.05)。 5.2.0×106 HL60/VCR细胞皮下接种BALB/c-nu/nu裸小鼠，15～20天成瘤，成瘤率为67.7％。 6.治疗组裸鼠瘤体体积、体重、外周血白血病数量、MDR1基因表达量均无明显差异(P＞0.05)。 研究结论： 1.选用真核表达质粒pcDNA3-3.1为载体，将VEGF121反向插入，成功构建VEGF反义核酸真核表达载体AS-pcDNA3-3.1-VEGF并转染HL60/VCR细胞，为研究VEGF反义核酸逆转HL60/VCR细胞耐药提供方法学基础。 2.1.25umol/mLAS-pcDNA3-3.1-VEGF与脂质体质量比为3：1转染HL60/VCR细胞72h，VEGF反义核酸对HL60/VCR的抑制作用最强。 3.VEGF反义核酸可有效抑制HL60/VCR细胞生长，下调VEGF蛋白和MDR1、MRP、GSTπ和ToPo Ⅱβ基因表达。 4.VEGF反义核酸抑制HL60/VCR细胞生长的机理是抑制细胞增殖，而不是促进细胞凋亡。 5.内源性VEGF具有抑制耐药白血病细胞增殖，改变细胞内微环境和细胞膜相关转运蛋白途径，降低细胞解毒和降低自我修复能力来逆转耐药。 6.VEGF反义核酸可提高HL60/VCR细胞对DNR、HT的敏感性，促进化疗药物诱导的细胞凋亡。 7.裸鼠接种HL60/VCR细胞，建立耐药白血病细胞动物模型，成瘤率为67.7％。 8.2.5mgVEGF反义核酸真核表达载体AS-pcDNA3-3.1-VEGF原位注射，不能提高荷瘤鼠对VCR的敏感性。 综合以上研究，VEGF反义核酸体外可有效抑制多药耐药白血病细胞生长，提高耐药白血病细胞对化疗药物的敏感性。但体内不能提高多药耐药荷瘤鼠对化疗药物的敏感性，相关实验研究有待于进一步深入。