非小细胞肺癌(NSCLC)在癌症引起的死亡中处于领先的地位。尽管在早期诊断和早期发现方面目前已经取得了不错的进展,但是多数的非小细胞肺癌的患者在被发现时已经处于进展期从而导致了患者的预后差,中位生存期也只有10-12个月。随着作用于EGFR的分子靶向药物的发现,比如吉非替尼和厄罗替尼的出现已经大大的提高了非小细胞肺癌的治疗效果。而其中,EGFR的外显子的突变状态又在预测EGFR-TKI的治疗疗效中起了重要的作甩。这些EGFR外显子的激活突变又往往跟腺癌相关组织学类型,吸烟与否,性别及种族有关系。因此,EGFR-TKIs已经被推荐用于EGFR外显子突变患者的一线治疗方案。但是不幸的是,这种治疗的显效性也会因为获得性耐药的出现而大受影响:大多数一开始对EGFR-TKI敏感的非小细胞肺癌患者在持续使用EGFR-TKI平均9-11个月后就会因为出现获得性耐药而导致疾病再次进展,其中大约50%的患者的获得性耐药的产生与20外显子EGFR的T790M突变有关,而另外20%的患者的获得性耐药则与MET基因扩增存在关系。因此,还有大约30%的患者产生了 EGFR-TKI获得性耐药的机制仍不清楚。微小RNA可以与mRNA的3’-非翻译区UTR结合从而发挥负性调节靶基因表达的作用。作为一类可以调节基因表达的非编码RNA,miRNA可以调节大约三分之一的基因表达,在调节细胞的增生,生长,分化和凋亡等方面发挥了重要的功能。最近的几年来,miRNA在调节肿瘤形成中的重要作用越来越被凸显出来。一些miRNA发挥着抑癌基因样的作用,因此这类miRNA的过表达可以抑癌作为促癌因子而发挥作用的一类靶蛋白。与短链的干扰RNA相比较,miRNA被认为在调节通路中与干扰RNA在许多的步骤上都非常的一致。miR-21是一个重要的促癌的微小RNA,它与肿瘤的生成与转移有着密切的关系。miR-21的高表达水平与结肠腺癌的不良预后和化疗敏感性高度的相关。此外,低表达miR-21则可以通过下调抗凋亡因子Bcl-2的表达而抑制乳腺癌细胞的生长。以上的结果在一起都说明了 miR-21的表达异常在肿瘤发展中所起的重要作用。因此我们也在本文中探索了 miR-21是否在调节非小细胞肺癌的EGFR-TKI的敏感性中也发挥了重要的作用。在本文中,我们先用qRT-PCR的方法检测了 47对NSCLC肿瘤组织及其相应的癌旁对照组织中miR-21的表达水平,发现miR-21在37/47(78.7%)的NSCLC肿瘤组织中的表达水平显著高于其在癌旁对照组织中的表达水平。同时由于PTEN作为一个miR-21重要的靶点,为了阐明两者表达在NSCLC组织中的表达水平的关系,我们用Western-Blot和免疫组化方法及方法检测了这47对NSCLC肺癌组织中PTEN蛋白的表达水平,结果表明:PTEN蛋白的表达水平在34/47(72.3%)的NSCLC癌组织中的表达水平是要显著低于其癌旁组织。Pearson相关分析也证明miR-21和PTEN蛋白的表达水平呈负性相关。Kaplan-Meier生存分析发现:miR-21相对表达量高的患者的无病生存时间要显著的短于miR-21相对表达量低的NSCLC患者。为了了解miR-21/PTEN表达异常与EGFR-TKI敏感性的关系,我们用用原位杂交及免疫组化的方案,检测了46例使用EGFR-TKI的患者石蜡切片组织中miR-21和PTEN的表达水平,并随访患者的临床疗效和生存时间。结果显示:使用EGFR-TKI后疾病进展(PD)的患者肺癌组织中的miR-21的表达水平要显著的高于部分缓解(PR)及疾病稳定(SD)的患者;miR-21高表达的患者的总生存时间要明显短于miR-21低表达的患者。此外,PD患者肺癌组织中的PTEN蛋白的表达水平要显著的低于PR及SD的患者,PTEN高表达的患者的总生存时间要明显长于PTEN蛋白低表达的患者。为了在细胞水平验证miR-21/Pten表达异常在调节EGFR-TKI敏感性中的作用,我们选用了吉非替尼敏感的pc-9细胞和吉非替尼耐药的pc-9/GR细胞作为研究对象,通过检测这两种细胞中miR-21和Pten表达水平我们发现与pc-9细胞相比较,pc-9/GR细胞也表现出miR-21的高表达和Pten蛋白的低表达。因此我们提出如下的科研假说:miR-21/Pten表达异常在调节pc-9细胞和pc-9/GR细胞对吉非替尼敏感性方面起着重要的作用。为了验证以上的假说,我们通过用miR-21 mimics过表达pc-9细胞中miR-21的水平,并用PTEN的过表达质粒来逆转miR-21过表达引起的PTEN蛋白低表达,并检测三组细胞的生物学特性。正如我们的假说,miR-21可以明显降低pc-9对吉非替尼的敏感性,而在转染miR-21的基础上再转染PTEN过表达的质粒则可以逆转这种药物敏感性的变化。我们还发现转染miR-21可以明显提高pc-9的侵袭转移和抗凋亡的能力,而在转染miR-21的基础上再转染PTEN过表达的质粒则可以逆转以上能力的改变。为了更为了更好的解释以上的功能变化。我们应用western-blot方法检测了以上三组细胞中,PTEN,PI3K/AKT,MEK/ERK通路相关蛋白的表达水平的改变。结果显示:与转染了 NC的pc-9细胞相比较,转染miR-21可以明显降低pc-9中PTEN的蛋白表达水平,提高P-AKT,P-ERK蛋白的表达水平,而在转染miR-21的基础上再转染PTEN过表达的质粒则可以逆转以上蛋白表达水平的变化。为了进一步的明确miR-21在调控pc-9/GR对吉非替尼耐药中的作用及机制,我们用我们通过用miR-21 inhibitor下调pc-9/GR细胞中miR-21的表达水平,并用PTEN的siRNA逆转miR-21低表达引起的PTEN蛋白下调,并检测三组细胞的分子生物学特性。CCK-8结果发现miR-21 inhibitor可以明显提高pc-9/GR对吉非替尼的敏感性,而在转miR-21 inhibitor的基础上再转染PTEN siRNA则可以逆转这种药物敏感性的变化。Trans-well和流式细胞检测发现:转染miR-21 inhibitor可以明显降低pc-9/GR的侵袭转移能力,促进吉非替尼诱导的细胞凋亡,而在转染miR-21 inhibitor的基础上再转染PTEN siRNA则可以逆转以上的变化。应用WB检测相关蛋白的表达结果显示:与转染了 NC的pc-9/GR细胞相比较,转染miR-21inhibitor可以明显升高pc-9/GR中PTEN的蛋白表达水平,降低P-AKT,P-ERK蛋白的表达水平,而在转染miR-21 inhibitor的基础上再转染PTEN siRNA则可以逆转以上蛋白表达水平的变化。为了更好的阐明miR-21在调控NSCLC耐吉非替尼中的作用,我们采用慢病毒感染的方法构建了稳定低表达miR-21的pc-9/GR细胞株。用包装好的携带anti-miR-21或者anti-Ctr的慢病毒分别感染pc-9/GR后种植于裸鼠皮下。动物实验结果显示:在稳定低表达miR-21的组裸鼠组,吉非替尼可以明显的抑制皮下移植瘤的的生长,低表达miR-21可以在动物水平提高pc-9/GR对吉非替尼的敏感性。通过本研究,我们发现了 miR-21/Pten表达异常是导致非小细胞肺癌对EGFR-TKI耐药的另一个机制。我们的发现将为以miR-2 1/Pten表达异常作为作为切入点研究克服吉非替尼耐药策略提供实验基础。