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背景:慢性乙型肝炎(CHB)威胁全人类健康,其中1/3以上的慢性感染者在中国。抗病毒治疗是慢性乙型肝炎的核心治疗措施。核苷类似物是目前抗病毒治疗的主流药物之一。恩替卡韦(ETV)作为强效抑制乙型肝炎病毒(HBV)的核苷类药物已逐渐在临床上得到应用。随着应用时间的推移和应用群体的扩大,ETV耐药问题逐渐出现。目前有关ETV耐药的研究国内外仅见个案报道,所以对我国ETV治疗失败的患者进行耐药检测,对其基因变异特点与临床特点进行初步分析,可以为ETV耐药后续的实验室研究和临床应用提供线索和依据。目前研究发现,ETV的耐药至少涉及逆转录酶区(RT区)3个位点的联合变异,且变异类型多样,还可能存在尚未发现的变异,所以实时(Real-Time)荧光PCR、限制性片段长度多态性(RFLP)及基因芯片等检测方法在建立上均比较困难,而PCR结合测序法则表现出很大的优势,具有更好的全面性。目的:1.建立一种可以较好扩增HBV RT区的巢式PCR(ntPCR)方法,结合直接测序和克隆测序法检测HBV耐药变异。2.对我国ETV治疗失败的患者进行初步的耐药基因变异特点与临床资料分析,为ETV耐药后续的实验室研究和临床应用提供线索和依据。方法:1.设计适于扩增HBV RT区较长基因片段的ntPCR引物并检验其效能。建立ntPCR-测序法耐药检测平台,包括PCR产物直接测序和PCR克隆测序法。2.筛集2008年1月~12月于北京地坛医院就诊的CHB患者中ETV治疗失败的患者血清20例。入选标准:符合2000年《病毒性肝炎防治方案》CHB诊断标准;患者规范服用ETV(剂量:核苷初治0.5mg/d,既往LVD治疗失败患者1.0mg/d)并且出现治疗失败,除外依从性等原因。PCR产物直接测序法检测20例标本的耐药情况,并分析其基因型。对其中的3例标本进行克隆测序,初步分析其耐药基因特点。20例患者依据病毒学应答情况,分为非完全病毒学应答组(6例)和病毒学突破组(14例),对这两组及不同基因型(B和C)的耐药检出情况进行统计学分析。结果1.琼脂糖凝胶电泳和测序法证实,ntPCR可扩增几乎整个HBV RT区(nt146- 1051)的位点,即rt5～rt318,包含有目前已知的所有变异位点,并且扩增序列涵盖了全长HBsAg编码区,可同时用于对HBV S基因变异的检测,还可以用于基因分型。扩增目的产物经直接测序确证无误。2. ETV治疗失败患者耐药检测结果:2.1 PCR直接测序法结果:⑴20例患者中检出ETV耐药11例,其RT区变异类型以rtM204V+rtL180M +rtT184L变异最多(8/11),其次是rtM204V+rtL180M+rtS202G(3/11),未发现rt250位点的变异。⑵扩增产物涵盖HBV DNA全长HBsAg编码序列,对其进行分析,20例患者中检出sP127T 2例,sP127T为已发现的与HBsAg免疫逃逸有关的变异。2.2对3例标本(1号、5号和9号)进行了克隆测序。结果提示同一模板重复PCR产物直接测序法检测在一定程度上可弥补其敏感度低的缺陷。2.3所有ETV耐药患者均来自病毒学突破组,非完全病毒学应答组患者中未检出ETV耐药,二者之间有统计学差异(P =0.0022)。2.4在11例ETV耐药患者中有10例既往有LVD治疗失败史,其从应用ETV到出现耐药变异的平均治疗时间为(19.43±2.72)月。2.5在6例B基因型患者中检出ETV耐药3例(3/6),14例C基因型患者中检出ETV耐药8例(8/14),二者之间无统计学差异。结论1.建立了一种较好扩增HBV RT区较长片段的方法,并涵盖全长HBsAg编码区。该法结合测序法可以用于HBV P基因RT区及S基因变异的检测,还可以用于基因分型。2.我国B和C基因型的乙肝患者中,ETV耐药类型以rtM204V+rtL180M+rtT 184L多见。3. ETV耐药主要见于病毒学突破组,多见于既往LVD治疗失败患者。4. ETV的耐药检出率在B和C基因型中无差别,结果可能受客观标本量影响,今后需进一步加大样本量进行验证。