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[目的]蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是一种非常严重的常见疾病,然而对其发生的病理机制复杂尚不明确。目前通常把血液中的氧合血红蛋白(Oxy-hemoglobin,OxyHb)认为是导致血管痉挛(cerebral vasospasm,CVS)的重要原因。Rho激酶已被证实是单体的G蛋白p的下游目标,其可以参与持续通过磷酸化的和抑制血管收缩。RhoA/Rho激酶通路在OxyHb的收缩作用中起作用,OxyHb在收缩血管时利用了 Rho易位的机制。ATP具有显著的血管收缩作用,并且有研究显示,平滑肌细胞可通过自分泌功能分泌ATP,但并未阐明ATP是否能作用于SAH后所致的脑血管痉挛,因此我想证实SAH条件下ATP的变化,从而讨论其是否可能和CVS有关系。缝隙连接是细胞间通信最常见的形式之一。它们由膜蛋白组成,形成离子和小分子之间的通道,这些离子和小分子连接着相邻细胞的细胞质。有研究表明,在不同的分类类群中,包括脊椎动物,存在着与特定的无脊椎缝隙连接蛋白被命名为innexins的同源基因,由PSI-BLAST搜索明确检测,并将其命名为pannexin-1(Panx1)。大量研究表明Panx1的激活会导致细胞外ATP水平升高,细胞内ATP作为细胞内代谢物通过Panx1通道被释放。在生理和病理生理条件下,细胞释放ATP;胞外ATP在被胞外酶(主要是CD39和CD73)快速降解为腺苷之前,起着自分泌和旁分泌的作用。细胞外ATP的作用由P2细胞表面受体(P2R)介导,其中包括跨细胞膜阳离子通道、P2X受体(P2XR)、G蛋白偶联受体、P2Y嘌呤能受体(P2YR)。P2XR代表ATP门控的同质或异体离子通道,由三个亚基组成,其中最重要的亚基是P2X1、P2X2、P2X3、P2X4 和 P2X7,ATP 对 P2X1 和 P2X4 敏感,ATP 通过激活 P2X嘌呤能受体影响影响机体功能。本课题以ATP作为重要血管收缩信号分子的理论基础,通过探究蛛网膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage,SAH)时ATP的浓度与血管痉挛的关系、抑制Rho和pannexin-1与ATP含量的关系以及SAH、Rho和pannexin-1表达量变化的关系以及SAH后P2X1和P2X4表达量的变化,从而证明SAH后脑动脉平滑肌细胞存在ATP的释放导致CVS的机制。[方法]OxyHb环境培养动脉平滑肌细胞以模拟SAH微环境,通过药理学方法抑制脑动脉平滑肌细胞Rho和pannexin-1(PANX1)后,用化学发光法检测培基中ATP浓度,蛋白印迹法检测OxyHb受体蛋白Rho、释放ATP的泛连接酶蛋白PANX1以及ATP受体P2X的表达水平。1.模拟体外蛛网膜下腔出血微环境:(1)大鼠血管平滑肌细胞株培养;(2)体外诱导蛛网膜下腔出血模型;(3)检测释放到细胞培养基的ATP浓度。2.特异性抑制剂抑制相关基因:(1)利用特异性抑制剂抑制脑动脉平滑肌细胞的Rho和pannexin-1(PANX1)基因;(2)用化学发光法检测培养基中ATP浓度,以验证OxyHb促ATP增加是否通过Rho-PANX1途径实现。3.免疫蛋白印记:(1)首先检测OxyHb受体蛋白RhoA;(2)检测释放ATP的泛连接酶蛋白PANX1;(3)检测ATP受体P2X1和P2X4的表达水平。4、统计学方法:样本数据是否符合正态分布采用K-S检验方法,样本数据是否符合方差齐性采用Levene检验。符合正太分布的多组比较采用ANOVA单因素方差分析,其中两两比较采用LSD方法分析;不符合正态分布的多组比较采用Kruskal-Wallis H检验,其中两两比较采用Bonferroni校正法。检测结果以均数±标准差(Mean±SD)或中位数(四分位数)表示,检验水准α=0.05,双侧P<0.05表示差异具有统计学意义。[结果]1.OxyHb可诱导脑动脉平滑肌细胞的ATP释放增加,OxyHb浓度为10μM作用时间24h时ATP相对浓度最高(对照组与10μM-24h组t=16.076,P=0.000,对照组与 10μM-48h 组 t=16.142,P=0.000)。2.分别抑制Rho或PANX1均可使ATP释放减少(t1=8.333,P1<0.001;t2=27.913,P2<0.001)。3.OxyHb混合培养基培养下的细胞Rho、PANX1蛋白表达量均升高。4.OxyHb混合培养基培养下的细胞P2X1、P2X4蛋白表达量均升高,P2X1表达最高值于第14天出现,P2X4表达最高值于第7天出现。[结论]1.蛛网膜下腔出血后脑ATP释放增加。2.动脉平滑肌细胞存在Rho-pannexin-1途径向胞外释放ATP。3.ATP受体P2X的表达亦上调。4.蛛网膜下腔出血后脑动脉平滑肌细胞能够通过Rho-PANX1途径促进胞外ATP的释放和受体P2X的表达上调,这可能是造成SAH后脑血流动力学障碍的机制之一,为临床解决SAH导致的血管痉挛提供新的思路。