麦芽四糖淀粉酶(Glucan1,4-alpha-maltotetraohydrolase, EC3.2.1.60)属于外切型淀粉酶,可以顺序地从淀粉非还原性末端依次切割第四个α-1,4糖苷键,产物为麦芽四糖(G4),广泛应用于食品、医疗、保健等领域。本实验室已将麦芽四糖淀粉酶基因克隆至枯草芽孢杆菌表达质粒pWB980中,构建得到枯草芽孢杆菌工程菌pWB980-G4/1A747,获得麦芽四糖淀粉酶外分泌表达,但该工程菌麦芽四糖淀粉酶产量有待进一步提高。本研究以pWB980-G4/1A747工程菌为研究对象,运用体外分子进化的策略,通过亚硝酸钠直接诱变质粒DNA分子法和G4淀粉酶结构基因易错PCR法进行突变体库构建,通过高通量筛选,获得突变菌株。对所获得的突变菌株进行菌落形态、淀粉水解能力等性质的比较以及蛋白质结构生物信息学分析,并对高产突变菌株进行发酵条件优化。主要研究内容和结果如下：(1)亚硝酸钠直接诱变质粒DNA分子法构建突变体库及筛选以枯草芽胞杆菌麦芽四糖淀粉酶工程菌pWB980-G4/1A747为研究对象,进行大量质粒抽提,使用终浓度为40mmol/L的亚硝酸钠溶液直接作用于裸露的完整质粒环状DNA分子,37℃诱变1h后终止反应,异丙醇回收突变质粒并转化枯草芽孢杆菌受体菌,共获得克隆子7200个,通过LBSP平板法进行初筛获得淀粉水解能力高于亲本菌株的疑似高产菌株118株,以及淀粉水解能力低于亲本菌株的负突变菌株15株,突变率达到1.85%；接着通过DNS法对疑似118株高产菌进行复筛,获得高产菌株59株,再进一步筛选最终获得两株淀粉水解能力提高50%以上的高产菌株,分别命名为N101、N102。(2)目的基因片段易错PCR法构建突变库以G4淀粉酶结构基因片段进行易错PCR法构建突变体库。为克服由于枯草芽孢杆菌导入外源DNA分子效率低(仅为大肠杆菌的1%),PCR产物消耗大的问题,本研究构建了T载体-G4/DH5α突变库寄存站,并对寄存站中所有大肠杆菌克隆子混合模糊化摇瓶培养提取质粒DNA,获得包含G4淀粉酶结构基因发生多种突变的混杂T载体-G4重组质粒库。接着对该质粒库中所有质粒进行统一酶切,收集含有多种突变的G4结果基因片段混合物,连接枯草表达质粒pWB980,转入枯草芽孢杆菌受体菌,获得pWB980-G4/1A747突变子167株,疑似负突变华东师范大学2014届硕士毕业论文6株,尚未获得正突变菌株。并发现在使用Easy taq聚合酶,PCR体系中dATP/dTTP为0.2mM、dGTP/dCTP为lmM、Mn2+为0.5mM的条件下对G4结构基因片段进行易错扩增时,1条DNA分子可发生23个碱基位点的突变,最优条件有待进一步确立。(3)突变菌株研究首先对两株高产突变菌株N101,N102,进行菌落形态观察,并分别使用透明圈法及DNS法测定发酵产物的水解淀粉能力变化,发现两株高产突变菌株在发酵24h后,淀粉水解能力分别提高了81%,114%,同时伴随着菌落表面更加潮湿的改变。在突变菌株麦芽四糖淀粉酶耐热性的探究中,两株高产菌发酵产物对淀粉水解的耐热性上保持原有水平。对两株高产菌进行质粒DNA测序,发现在启动子、信号肽、结构基因位置均未发生碱基水平的改变,突变原因及机制尚不确定。对高产突变菌株N102进行发酵条件优化,综合菌体浓度和相对酶活力两项指标,得出最优表达条件为：菌种活化10h,以5%接种量,装瓶量50ml/150ml,0.2%TWEEN80分泌促进剂,37℃培养24h。优化后的菌体密度提高了32.69%,相对酶活提高了33.33%。对负突变菌株F002,F004进行质粒DNA测序分析。发现F002于结构基因核苷酸序列中发生1234位C-T的碱基置换,使得终止密码子提前出现,导致G4淀粉酶蛋白C端18个氨基酸的丢失,F002因此完全丧失活性；同时发现突变株F004仅发生位于结构蛋白氨基酸序列389位丝氨酸置换为亮氨酸的点突变,同样导致酶活完全丧失。以S389L-淀粉酶突变体F004为研究对象,通过生物信息学研究分析发现,该突变位点位于一段保守序列中。该保守序列分别还存在于嗜糖假单胞菌来源(pseudomonas sp.)的α-淀粉酶,门多萨假单胞菌(pseudomonas mendocina.)来源的葡聚糖α-1,4-麦芽四糖水解酶,及Hahella chejuensis来源和Reinekea blandensis来源的糖苷酶结构蛋白中。该结构域被Pfam数据库命名为DUF1921,功能未知。在本研究中发现该段结构域的缺失或改变会导致麦芽四糖淀粉酶彻底丧失活性,暗示该结构域在麦芽四糖淀粉酶水解淀粉过程中扮演重要角色。同时通过对五种不同来源的DUF1921序列比对发现,389位丝氨酸处于绝对保守,提示该位点可能对维持该结构域的结构及功能有重要影响,进一步的研究的工作尚有待开展。综上所述,本文对现有的枯草芽孢杆菌麦芽四糖淀粉酶工程菌进行体外分子进化,通过亚硝酸钠直接诱变重组质粒法及G4淀粉酶结构基因易错PCR的方法,成功构建了含有7367个突变子的突变体库,并筛选到高产菌株N101、N102,其中N102突变菌株的淀粉水解能力提高了114%,其突变原因及机制尚不明确。此外,本文首次获得了DUF1921结构域发生改变的两种类型麦芽四糖淀粉酶负突变体,对该结构域进行生物信息学分析,推测该结构域可能与a-1,4-糖苷键形变发生有关。以上研究成果,对麦芽四糖淀粉酶结构学理论研究及生产实践具有参考意义。