论文部分内容阅读
研究背景:胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤,五年生存率仅为15-20%,化疗作为中晚期胃癌、术后复发转移及残胃癌的主要治疗手段之一,在肿瘤治疗中有着重要的地位。但随着化疗药物的广泛应用,肿瘤对其耐药性日益增加,肿瘤的多药耐药（Multidrug Resistance,MDR）成为了阻碍胃癌化疗成功的主要原因。因此,克服肿瘤的MDR问题将引起肿瘤化疗效果的突破并将为肿瘤的治疗开拓广阔的前景。蛋白质组学作为后基因组学时代研究的一个重要内容,已广泛深入到生命科学和医药学的各个领域,其理论和技术的发展完善为肿瘤多药耐药研究带来了新的思维方式和研究领域,它可以从组织或细胞蛋白质整体水平这一全新角度来研究肿瘤多药耐药机制。本课题组应用蛋白质组学技术对人胃癌细胞株SGC7901,阿霉素诱导的耐药细胞株SGC7901/ADR和丹参逆转后的耐药细胞株进行蛋白质组学的差异比较,并通过高效液相色谱电喷雾电离飞行串联质谱对差异蛋白质进行鉴定,结果发现,S100A6在人胃癌细胞株SGC7901中高表达,其多药耐药细胞株SGC7901/ADR中表达下调,不表达或低表达,经丹参逆转多药耐药后表达上调,再次呈高表达。但这种差异表达需进一步验证。本研究通过运用免疫细胞化学,Western-blot, RT-PCR技术对S100A6在SGC7901和SGC7901/ADR细胞中的表达水平进行检测,旨在进一步证实双向电泳和串联质谱技术发现的差异表达,探讨S100A6与胃癌MDR的关系,为发现新的与胃癌多药耐药相关的蛋白质分子,进一步研究胃癌多药耐药机制奠定基础。研究目的:验证并检测S100A6在SGC7901和SGC7901/ADR细胞中的差异表达,进一步探讨S100A6与胃癌多药耐药的关系。实验方法:人胃癌细胞株SGC7901和SGC7901/ADR细胞传代培养,应用细胞爬片技术将传代培养的SGC7901和SGC7901/ADR细胞种植于0.8×0.8cm2大小置于24孔板的预处理盖玻片上正常培养48小时,MaxVisionTM快捷免疫组化两步法初步观察S100A6分别在SGC7901及SGC7901/ADR细胞中的表达水平的差异;依据全蛋白提取试剂盒说明书化学裂解法提取SGC7901和SGC7901/ADR细胞总蛋白,RNA提取试剂提取两种细胞总RNA,用Western-blot和半定量RT-PCR技术分别从蛋白质水平和RNA水平对S100A6在SGC7901和SGC7901/ADR细胞中的表达水平进行检测和分析,从而验证了比较蛋白质组学结果,同时进一步探讨S100A6与胃癌多药耐药的相关性。实验结果:免疫细胞化学法检测发现,S100A6在SGC7901细胞中呈高表达,染色为强阳性（ +++ ）,胞浆深染呈棕黄色-棕褐色;SGC7901/ADR细胞中S100A6表达量明显降低,染色为弱阳性（+）,胞浆染成淡黄色;Western-blot结果:提取两种细胞全蛋白经SDS-PAGE电泳,Western-blot免疫印迹分析,发现,S100A6在SGC7901细胞中高表达,在SGC7901/ADR细胞中低表达,转膜后的蛋白条带经BandScan5.0条带分析软件测得其灰度值分别为,SGC7901细胞S100A6 IOD（X|-）:110.236 ,SGC7901/ADR细胞S100A6 IOD（X|-）:62.701,以β-actin为内标校正蛋白,重复三次实验测得S100A6在SGC7901中的平均表达量为4.356±0.759,在SGC7901/ADR中的平均表达量为2.243±0.089,以均值作两独立样本的t检验,经统计学分析,P=0.039,P﹤0.05,差异具有显著性;半定量RT-PCR结果:提取两种细胞总RNA,行半定量RT-PCR。扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,SGC7901细胞S100A6基因条带信号强度与SGC7901/ADR细胞相似,各基因条带经BandScan5.0条带分析软件测得其灰度值分别为, SGC7901细胞S100A6 mRNA IOD（X|-）:16979, SGC7901/ADR细胞S100A6 mRNA IOD（X|-）:11682.以GAPDH为内标基因,重复三次实验,测得SGC7901中S100A6 mRNA的平均表达量为0.659±0.017,SGC7901/ADR中S100A6 mRNA的平均表达量为0.582±0.06,两均值作独立样本的t检验,经统计学分析,P=0.15,P﹥0.05,差异不具有显著性。结论: 1.S100A6蛋白在人胃癌细胞SGC7901及其耐药细胞SGC7901/ADR中存在差异性表达,在SGC7901细胞中呈高表达,在耐药SGC7901/ADR细胞中呈低表达;2. S100A6的mRNA在SGC7901细胞及其耐药细胞SGC7901/ADR中无差异表达,其蛋白在SGC7901细胞及其耐药细胞SGC7901/ADR中的差异表达是翻译后事件,可能与S100A6在耐药细胞中的降解增多有关。3. S100A6蛋白在耐药细胞SGC7901/ADR中表达下降可能与其多药耐药相关。