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通络救脑注射液是由中药栀子的主要成分栀子苷和三七主要药效组分三七总皂苷所组成的,是基于中医“毒损脑络”病机理论研发的一种用于急性期缺血性脑卒中的复方新药。在中风治疗中,其作用效果并非栀子苷或是三七总皂苷单一组分可比拟的,发挥着中药复方配伍的优越性,无论在实验室研究中还是在临床试验中,通络救脑注射液对缺血性脑卒中都发挥着良好的治疗作用。相关药理研究显示该药可通过多种途径抑制脑缺血的发生与发展,对脑微血管内皮细胞具有明显的保护作用。实验室前期通过基因芯片技术对该药的靶基因进行筛选,我们发现在拟缺血损伤的脑微血管内皮细胞中,通络救脑注射液及其两组分对谷氨酸受体GluR3的mRNA具有显著下调作用。传统研究中认为谷氨酸受体在神经元、胶质细胞中存在,并参与脑损伤,但对于谷氨酸受体在脑微血管内皮细胞中是否表达并发挥作用,却鲜有报道,因此依据基因芯片的结果提示,探究谷氨酸受体GluR3在脑微血管内皮细胞中是否表达、如何发挥作用成为本课题研究的创新点。本实验在前期研究的基础上,以该注射液的两个有效组分栀子苷和三七总皂苷作为对照,在模拟缺血损伤的脑微血管内皮细胞中,观察了通络救脑注射液对GluR3 mRNA和蛋白表达的影响,以及对GluR3调节的下游相关蛋白表达的影响,以进一步揭示通络救脑注射液发挥血管保护作用的新的分子靶点,同时阐释该复方新药的配伍优势。目的：观察通络救脑注射液及其两组分对拟缺血损伤的脑微血管内皮细胞上谷氨酸受体GluR3的影响,及GluR3下游可能影响到的相关蛋白表达情况,以揭示通络救脑注射液在脑缺血损伤中发挥血管内皮保护作用的分子机制。方法：1.采取本实验室已建立的脑微血管内皮细胞培养方法,利用SD大鼠进行脑微血管内皮细胞的原代取材、分离纯化、培养与传代。将传至第3代的高纯度微血管内皮细胞,采用本实验室已完善的氧糖剥夺造模方法制备缺血损伤模型。2.通络救脑注射液由中药栀子、三七有效成分配伍而成,故本研究中以两种组分栀子苷和三七总皂苷作为对照。将细胞分成5组,即正常组、缺血模型组、栀子苷组、三七总皂苷组、通络救脑注射液组。除正常组外,其余各组造模,三个给药组在造模前和造模中加入相应的药物,通络救脑注射液注浓度为4μl/ml,栀子苷终浓度33.2gμg/ml；三七总皂苷终浓度22μg/ml; (栀子苷与三七总皂苷的终浓度同通络救脑注射液组的浓度)。处理后,利用荧光定量PCR、Western blotting法检测GluR3mRNA及蛋白的表达情况。3.在以上五组的基础之上,添加GYKI52466 (GluR3阻断剂)组,利用Western blotting法检测各组GluR3下游蛋白CD147、MMP-9的表达情况。4.用免疫印迹法检测各组细胞occludin蛋白表达情况。5.为验证GluR3受体在脑微血管中表达,选取SD大鼠制备大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion model, MCAO)模型,利用免疫组化法对脑组织GluR3、occludin蛋白进行标记定位。6.统计学方法：所得实验数据以均数士标准差(x±s)表示,选用S PSS20.0进行统计分析,比较组间差异选用单因素方差分析(ANOVA), P<0.05有统计学意义。结果：1.荧光定量PCR与免疫印迹VWestern blotting的实验数据表明GluR3在脑微血管内皮细胞上表达,且动物脑组织免疫组化结果验证了其定位。2.通络救脑注射液及其组分对拟缺血脑微血管内皮细胞GluR3的影响。荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,缺血缺氧造模后,脑微血管内皮细胞中GluR3表达显著上调。各个给药组与模型组相比,药物在不同程度上均可下调该蛋白的表达,且通络救脑注射液组下调效果优于两组分。3.通络救脑注射液及其组分对拟缺血脑微血管内皮细胞CD147、MMP-9的影响。Western blotting的结果表明,氧糖剥夺后内皮细胞CD 147、MMP-9的表达显著上调,各给药组两种蛋白的表达均下降,且通络救脑注射液下调程度优于其两组分。GluR3阻断剂也显著下调CD147、MMP-9的表达。4.通络救脑注射液及其组分对拟缺血脑微血管内皮细胞occludin的影响。Western blotting结果显示,拟缺血损伤后内皮细胞occludin蛋白明显下调,三种药物均在不同程度上对其有上调作用,且通络救脑注射液的作用更明显。各组occludin的表达情况和MMP-9呈负相关。在动物实验的免疫组化结果中可观察出紧密连接蛋白occludin在各组表达的差异,与细胞实验结果一致。结论：1.本研究发现GluR3在SD大鼠的脑微血管内皮细胞中表达,缺血性损伤后GluR3的表达水平显著上升,GluR3阻滞剂GYKI52466的作用提示,该受体通过激活CD147,上调MMP-9,促进紧密连接蛋白occludin的降解,提示GluR3可能参与了脑缺血中血脑屏障的损伤过程。2.通络救脑注射液可有效下调拟缺血损伤脑微血管内皮细胞GluR3的表达,同时可下调该受体的下游蛋白CD147.MMP-9的表达,减少血脑屏障相关蛋白occludi n的降解,提示GluR3可能是该注射液发挥保护血脑屏障作用的分子靶点之一。3.通络救脑注射液及两组分对CD147、MMP-9、occludin均有明显的调节作用,且注射液效果优于单一组分,显示了中药复方的配伍优势。