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研究背景:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是以脑内β淀粉样蛋白（β-amyloid protein,Aβ）过度沉积,神经原纤维缠结,以及广泛神经元损伤丢失和认知、记忆减退为主要特征的高发于老年人群的慢性神经退行性疾病。AD自首次报道以来迄今已逾百年,尽管其发病机制尚未完全阐明,但大量的研究证实:中枢神经炎症在AD病理进程中发挥着重要作用。因此,探讨中枢炎症核心效应物-白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）的作用,将有助于阐明AD炎症病理,为AD临床干预治疗提供基础的理论支持。IL-1β是AD炎症核心的效应分子,基于其促发炎症但也减轻脑内Aβ沉积的研究报道,和课题组适宜IL-1β的早期存在有利于改善损伤神经元修复的实验发现,我们提出:IL-1β伴随AD病变发展而表现与浓度时间差异关联的神经元保护与损伤“双刃”效应。具体而言,生理或病理早期的低浓度IL-1β有利于神经元微环境适应,改善神经元存活;而长期病理因素（如Aβ清除不足过量沉积）诱导IL-1β超高蓄积（IL-1β过载）,介导IL-1β效应由神经保护转为神经损伤（本文简称IL-1β“双刃”效应失稳）,推动AD病变发展。针对课题假设,我们需要明确:①中枢IL-1β为何异常升高?即中枢IL-1β过载的原因是什么?②中枢IL-1β为何会表现“双刃”效应?即IL-1β“双刃”效应的分子基础是什么?研究证实,AD病理条件下沉默信息调节因子1（Silent information regulator type1/Sirtuin1,SIRT1）表达显著减少,而IL-1β剪切成熟关键信号NLRP3明显激活;提示SIRT1-NLRP3负相关并可能参与AD炎症病理下IL-1β的生成调控。研究也表明,成熟脑源性神经营养因子（mature Brain-derived neurotrophic factor,mBDNF）和前体BDNF（precursor BDNF,proBDNF）均执行独立的生物功能,但proBDNF与mBDNF的作用截然相反,mBDNF改善神经元存活,而proBDNF诱导神经元损伤。结合课题组IL-1β参与BDNF表达调控的实验报道。我们进一步综合推测:生理条件下,SIRT1高表达,抑制NLRP3炎性复合物过激,限制小胶质细胞IL-1β剪切活化,保持脑内低IL-1β水平,缓和proBDNF表达,维持中枢mBDNF/proBDNF信号平衡,表现神经保护效应;而在Aβ过度沉积等病理条件下,SIRT1表达下调,对NLRP3炎性复合物抑制减弱,NLRP3炎性复合物过度激活致使小胶质细胞成熟IL-1β释放增多（IL-1β过载）,促进proBDNF表达,mBDNF/proBDNF信号失衡,表现神经损伤效应。为验证上述假说,本研究开展了两部分实验工作,分别从SIRT1信号调控与IL-1β关联,IL-1β效应与BDNF作用联系,探讨AD病理相关中枢IL-1β过载的分子参与机制,分析IL-1β“双刃”效应与BDNF信号变化的执行传递,从而验证“SIRT1-NLRP3信号驱动IL-1β过载,联动mBDNF/proBDNF失衡,介导IL-1β“双刃”效应失稳,推进AD病理”的项目假说。第一部分:SIRT1-NLRP3信号与IL-1β过载的实验研究实验方法:培养BV2小鼠小胶质细胞,以Aβ孵育模拟AD病理,构建SIRT1过表达质粒并转染细胞,设置:①空白对照组;②转染试剂对照组;③SIRT1过表达质粒对照组;④Aβ实验组;⑤Aβ+转染试剂实验组;⑥Aβ+SIRT1过表达质粒实验组。Aβ作用48小时后,收集细胞及培养上清,Western Blot实验检测NLRP3炎性复合物（NLRP3、ASC、Caspase-1）,SIRT1及上游调控AMPK信号,M1型小胶质细胞激活标志物CCL3和M2型小胶质细胞激活标志物Arg1蛋白表达;免疫荧光双标实验标记M1型和M2型小胶质细胞激活变化;ELISA实验测定细胞培养上清中IL-1β含量。实验结果:1.SIRT1信号限制AD相关NLRP3过激活与对照组比较,Aβ组细胞NLRP3、Caspase1和ASC表达均显著上调,而SIRT1表达明显下调;但SIRT1高表达质粒转染明显对抗Aβ诱导的NLRP3等表达变化,提示SIRT1信号负调AD相关的NLRP3信号激活,表现潜在的减少小胶质细胞IL-1β释放的作用;2.SIRT1信号减少AD相关M1型小胶质细胞活化与对照组比较,Aβ组细胞Arg1蛋白表达显著下降,Arg1阳性细胞数减少;而CCL3蛋白表达增多,阳性细胞数也伴随增多;但SIRT1高表达质粒转染明显逆转Aβ诱导的上述改变,提示SIRT1信号干预小胶质细胞活化,减少产IL-1β的M1型小胶质细胞活化,有助于减轻AD相关IL-1β过载;3.SIRT1信号减少IL-1β生成释放与对照组比较,Aβ组细胞IL-1β含量明显升高;SIRT1高表达质粒转染明显减少Aβ诱导的IL-1β释放,提示SIRT1缓解AD相关IL-1β过载;4.AMPK信号削弱SIRT1表达与对照组比较,Aβ组细胞SIRT1表达下调的同时,磷酸化AMPK表达明显减少,提示干预AMPK信号激活可能是AD病理限制SIRT1表达的分子参与途径。结论:1.SIRT1信号抑制NLRP3激活,减轻AD相关中枢IL-1β过载;2.SIRT1信号调控小胶质细胞激活分化,减少AD相关M1型小胶质细胞激活可能是其改善中枢IL-1β过载的细胞基础;3.抑制AMPK信号磷酸化激活可能是AD病理下SIRT1失表达,IL-1β过载的上游参与机制;第二部分:mBDNF/proBDNF信号平衡与IL-1β神经元保护/损伤“双刃”效应的实验研究实验方法:HT22小鼠海马神经细胞与差异浓度/时间的IL-1β共孵育,设置:①空白对照组:②0.02ng/ml IL-1β 实验组;③0.05ng/ml IL-1β 实验组;④0.1ng/ml IL-1β 实验组;⑤1ng/ml IL-1β 实验组;⑥10ng/ml IL-1β 实验组;⑦20ng/ml IL-1β 实验组。IL-1β与细胞均分别作用6h、12h、24h、48h、72h、96h,每个时间点均收集细胞;采用CCK8实验检测细胞活性;Western Blot实验检测mBDNF、proBDNF及其受体TrkB、p75NTR,proBDNF 剪切成熟相关因子 Furin、PC1/3 蛋白表达,Real-time PCR实验检测BDNF表达调控相关信号分子MEK、ERK、CREB等mRNA表达。实验结果:1.IL-1β表现作用浓度时间关联“双刃”效应CCK8实验结果显示,与对照组比较,低浓度IL-1β在其作用的12-72小时均表现出明显的促细胞增殖作用;而随着作用时间的延长,高浓度IL-1β细胞损伤效应逐渐显现,在48和72小时的作用时间点,高浓度IL-1β均诱导显著的细胞损伤,提示IL-1β存在与作用浓度和时间相关联的神经元保护/损伤“双刃”效应;2.IL-1β“双刃”效应与mBDNF/proBDNF信号关联Western Blot实验结果显示:伴随IL-1β作用浓度升高和时间延长,mBDNF表达下调而proBDNF表达上调;而且,高浓度IL-1β作用下,mBDNF受体TrkB表达减少而proBDNF受体p75NTR表达增多,提示IL-1β可能诱导细胞mBDNF/proBDNF信号失衡,干预BDNF信号传递执行,参与浓度相关IL-1β神经保护-损伤“双刃”效应的转换;3.IL-1β调控BDNF信号Western Blot结果显示,与对照组比较,高浓度IL-1β作用下,proBDNF剪切成熟蛋白Furin和PC1/3表达明显减少;而real-time PCR结果显示,与对照组比较,高浓度IL-1β抑制MEK、ERK、CREB等mRNA表达,而低浓度IL-1β促进MEK和ERK表达,但对CREB表达无明显效应;提示IL-1β干预BDNF转录过程、调控BDNF剪切成熟。结论:1.与作用浓度及时间关联,IL-1β兼具神经保护/损伤“双刃”效应;2.mBDNF/proBDNF信号失衡参与IL-1β介导的神经保护/损伤“双刃”效应过程;3.调控BDNF成熟剪切等信号可能是IL-1β干预mBDNF/proBDNF信号平衡的重要分子作用途径。