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环化酶1（Butelase 1）是最新发现的一种特异性天冬氨酸/氨酰多肽连接酶,既具有蛋白酶切割的特异性功能,也能够作为多肽连接酶高效催化来源于多种有机体的线性肽和蛋白质环化形成环状结构,从而增强环化后多肽和蛋白质抵抗蛋白酶、化学及热力学等因素降解的能力。为获得可溶性的Butelase 1蛋白,本研究构建了butelase 1基因的4种重组原核表达载体,利用融合标签技术在大肠杆菌原核表达系统中表达可溶性的Butelase 1蛋白,并比较不同融合标签对提高Butelase 1蛋白的可溶性效果;还构建了1种毕赤酵母真核表达载体,利用毕赤酵母真核表达系统表达Butelase 1蛋白,通过酶切和环化反应检测蛋白活性。主要试验如下:1.将butelase 1基因插入到带有融合标签的pET21b表达载体上,重组原核表达载体经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21细胞中诱导融合蛋白的表达,获得的可溶性融合蛋白经Ni-NTA亲和层析法纯化。SDS-PAGE鉴定,结果表明His6-Grifin-Butelase 1和His6-GST-Butelase 1融合蛋白为包涵体,His6-NusA-Butelase 1融合蛋白主要为可溶性表达,部分为包涵体,His6-MBP-Butelase 1为几乎全部为可溶性表达。纯化得到的His6-NusA-Butelase 1和His6-MBP-Butelase 1融合蛋白经Western blot鉴定为特异性表达。2.将butelase 1基因连接到pPIC9K表达载体上构建真核表达载体,电转化方法转化至毕赤酵母GS115细胞中,甲醇诱导Butelase 1蛋白的分泌表达,500 mL表达产物离心收集上清,真空过滤除去杂质,浓缩至400μL。Western blot鉴定,结果表明有可溶性Butelase 1蛋白的表达。3.大肠杆菌表达的His6-SpyTag-sfGFP-SpyCatcher蛋白（43.2 kD）经毕赤酵母表达的Butelase 1酶切,SDS-PAGE检测,原蛋白被Butelase 1酶切成2条肽段,一条为16.4kD（His6-SpyTag-SpyCatcher）,另一条肽段为26.8 kD（sfGFP）,结果表明真核表达产生的Butelase 1具有蛋白水解酶活性。以Butelase 1催化线性肽G-LL37-NHV（4900 Da）环化,经Tricine-SDS-PAGE鉴定,反应后出现2条条带,其中1条为未被环化的原线性肽G-LL37-NHV,另一条为反应产生的环肽G-LL37（4646 Da）,初步表明毕赤酵母真核表达系统表达的Butelase 1具有环化酶活性。综上所述,本文构建了带有融合标签的4个重组原核表达载体:pET21b-His6-Grifin-Butelase 1、pET21b-His6-GST-Butelase 1、pET21b-His6-NusA-Butelase 1和pET21b-His6-MBP-Butelase 1,筛选出MBP标签能够显著提高Butelase 1蛋白的可溶性表达,其次是NusA标签;构建了1种毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K-Butelase 1,诱导表达可获得Butelase 1蛋白,经鉴定该蛋白具有活性。本研究成功建立了Butelase 1蛋白的可溶性大肠杆菌原核表达系统和毕赤酵母真核表达系统,且毕赤酵母表达的Butelase 1能够催化线性肽环化。本研究为环状抗菌肽的研究与应用提供了技术基础,将有助于新型环肽类药物的设计与开发。