【摘 要】
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目的:糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)的发病机制与自噬功能紊乱密切相关。生脉散是临床治疗糖尿病气阴两虚的代表方,亦被广泛应用于缺血性心肌病及心衰的治疗。目前为止,生脉散对DCM的确切作用仍不明确。本课题利用整体动物和细胞实验来观察生脉散对糖尿病心脏和自噬的影响;在明确生脉散改善DCM心脏功能的基础上,进一步探讨其作用机制。方法:(1)在整体动物水平,利用瘦素受
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目的:糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)的发病机制与自噬功能紊乱密切相关。生脉散是临床治疗糖尿病气阴两虚的代表方,亦被广泛应用于缺血性心肌病及心衰的治疗。目前为止,生脉散对DCM的确切作用仍不明确。本课题利用整体动物和细胞实验来观察生脉散对糖尿病心脏和自噬的影响;在明确生脉散改善DCM心脏功能的基础上,进一步探讨其作用机制。方法:(1)在整体动物水平,利用瘦素受体缺陷的db/db小鼠作为2型糖尿病小鼠模型,同时选取其同周龄背景系C57BLKS小鼠作为非糖尿病对照。按照分组情况,生脉散干预组分别用不同剂量的生脉散灌胃(3和4.5g/kg/day),糖尿病模型组和非糖尿病对照组则给予等体积蒸馏水灌胃。各组处理4周后检测小鼠体重、血糖、血脂、糖耐量、心脏结构及心重与胫骨长比值;通过M型超声和脉冲及组织多普勒观察心室内径及心脏功能的变化;利用高效液相法(HPLC)测定小鼠心肌组织ATP、ADP和AMP含量;透射电镜观察心肌超微结构、脂滴分布以及自噬的情况;同时结合免疫印迹法测定心肌组织Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62及CTSD等的表达,以阐明生脉散对DCM小鼠心脏功能及自噬的影响。(2)在体外细胞水平,利用高糖高脂处理H9C2心肌细胞模拟2型糖尿病损伤模型,进一步探讨涉及生脉散发挥心肌保护作用的机制。通过CCK8实验测定细胞存活率;利用DCFH-DA和mito-SOX荧光探针孵育以观察细胞及线粒体内活性氧的改变;免疫印迹法检测AMPK/mTOR及其下游自噬信号的蛋白表达;同时利用GFP-RFP-LC3-Ⅱ腺病毒转染观察细胞自噬流的变化,以阐明对心肌自噬流的调节是否参与生脉散的保护作用。结果:(1)在整体动物水平,我们发现:①与非糖尿病小鼠相比较,db/db模型组小鼠体重、血糖和血脂均明显升高、糖耐量水平降低、同时伴有左室肥大和心脏舒张功能障碍,其收缩功能与非糖尿病小鼠相比并无显著性差异;一定剂量的生脉散(3g/kg/day)处理4周后,可明显降低db/db小鼠血脂的增高、缓解左室肥大及心脏舒张功能障碍。②透射电镜观察发现:与非糖尿病小鼠相比较,db/db模型组小鼠心肌线粒体明显损伤、脂滴显著增加并伴有大量自噬体的存在;HPLC结果提示db/db模型组小鼠心肌ATP和ADP含量降低;一定剂量的生脉散处理可缓解心肌超微结构损伤、减轻脂滴积聚及自噬体数目、改善db/db小鼠心肌能量障碍。③免疫印迹法发现:与非糖尿病小鼠相比较,db/db模型组小鼠心肌组织内自噬相关蛋白表达改变(具体表现为Beclin1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达增高,而P62及CTSD表达降低);以上现象可被一定剂量的生脉散逆转。(2)在体外细胞水平,利用高糖高脂处理H9C2心肌细胞模拟2型糖尿病损伤模型,我们发现:①高糖高脂处理导致H9C2心肌细胞存活率下降、细胞及线粒体内活性氧含量显著增高。一定剂量的生脉散(1.42～5.68mg/ml)可改善高糖高脂心肌细胞存活率、缓解细胞及线粒体活性氧水平的升高。②高糖高脂处理导致H9C2心肌细胞内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和P62蛋白表达显著上升,该过程伴随着AMPK/mTOR自噬调控信号的改变,利用GFP-RFP-LC3-Ⅱ腺病毒转染观察细胞自噬流或药理学干预等方法,我们发现生脉散可通过调控AMPK/mTOR自噬信号来改善高糖高脂心肌细胞自噬流障碍。结论:(1)生脉散改善db/db糖尿病小鼠血脂含量及心肌能量水平、缓解心室肥大及舒张功能障碍;(2)生脉散缓解db/db糖尿病小鼠及高糖高脂处理H9C2心肌细胞自噬流障碍;(3)生脉散的糖尿病心肌保护作用涉及对AMPK/mTOR相关自噬信号的调控。
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