胰腺癌是致死率最高的肿瘤之一,五年生存率小于5%[1,2]。美国在过去的5年内,因胰腺癌每年死亡的人数超过30000人[3,4]。传统治疗手段包括手术、放疗[5]、化疗[6]等,疗效均有限[7-10]。胰腺癌的早期预防、诊断、治疗十分重要,亟待对其发病及进展原因的分子生物学基础进行深入研究[11]。GS homeobox 2(GSH2)基因,同时也称作GSX2基因,是同源盒基因家族的一员,定位于染色体4q12,由304个氨基酸组成[12]。GSH2基因是同源盒基因家族的一员,调控细胞的增殖、分化、凋亡、迁移、侵袭等功能。在胚胎神经发育及神经胶质瘤形成中[13],GSH2协同SHH信号通路参与上述过程说明两者联系密切相关,SHH通路在胰腺癌的发生发展中起重要作用[14-16],而GSH2在胰腺癌中的作用未见报道。本实验检测胰腺癌组织中GSH2基因的表达情况。通过RNA干扰技术[17]靶向沉默GSH2基因,检测对胰腺癌SW1990细胞的增殖、迁移、侵袭等功能,吉西他滨敏感性[6]及HH信号通路通路关键分子SHH、GLI1的影响[14-16]。通过Co-IP[18-20]技术检测在SW1990细胞中GSH2同SHH及GLI1的相互作用。第一部分GSH2基因在胰腺癌组织中的表达目的:检测胰腺癌组织中GSH2基因的表达情况。材料与方法:收集胰腺癌组织及癌旁正常组织各3例,通过HE染色、免疫组织化学染色法检测GSH2的表达情况。以癌旁正常组织为对照,用RT-PCR法检测GSH2基因在m RNA水平表达的差异,蛋白印迹法检测GSH2基因在蛋白水平表达的差异。结果:本部分实验中免疫组化显示GSH2在癌组织中表达明显强于癌旁正常组织,主要表达在胰腺癌导管细胞的细胞核部位。RT-PCR结果显示癌组织中GSH2的相对表达量:8.40±0.32,癌旁组织GSH2相对表达量:0.95±0.04,提示胰腺癌癌组织中GSH2的m RNA表达量较对照组高(t=23.27,p<0.001)。蛋白印迹法结果提示胰腺癌癌组织中GSH2的蛋白表达量较对照组高。结论:GSH2基因在胰腺癌组织中高表达。第二部分沉默GSH2对胰腺癌SW1990细胞增殖、迁移、侵袭、吉西他滨敏感性及HH信号通路关键分子SHH、GLI1的影响目的:沉默GSH2对胰腺癌SW1990细胞增殖、迁移、侵袭、吉西他滨敏感性及HH信号通路关键分子SHH、GLI1的影响。材料与方法:用siRNA技术靶向沉默胰腺癌SW1990细胞的GSH2基因后,以转染NC-siRNA的细胞做对照,检测细胞增殖(CCK-8法)、迁移(Transwell法)、侵袭(Invasion Chamber法)能力变化。并联合吉西他滨处理,检测处理后细胞增殖及凋亡(流式细胞仪)的变化。构建靶向沉默GSH2基因的sh RNA载体质粒,并筛选沉默效果最佳者。用siRNA及sh RNA沉默GSH2基因,分别以转染NC-siRNA及转染空载质粒的细胞做对照。通过RT-PCR[21]及蛋白印迹法检测GSH2基因在m RNA及蛋白水平的沉默效率,并检测HH信号通路关键分子SHH及GLI1在m RNA及蛋白水平的变化。结果:沉默GSH2基因后,细胞在450nm的吸光值为2.89±0.02,低于对照组(3.39±0.02;t=20.74,p<0.001);迁移透膜细胞数为157.2±6.71,低于对照组(349.3±8.33;t=17.95,p<0.001)侵袭透膜细胞数63.21±1.16,低于对照组(95.71±3.51;t=8.79,p<0.001)。联合吉西他滨处理后,细胞在450nm的吸光值为2.48±0.02,低于对照组(2.89±0.02;t=17.24,p<0.001);细胞凋亡百分为39.70%±0.52%,高于对照组(26.38%±1.17%;t=10.39,p<0.001)。成功构建sh RNA重组质粒并筛选出沉默效果最佳者。siRNA有效沉默GSH2后,RT-PCR检测GLI1、SHH m RNA相对表达量分别为0.21±0.01、1.07±0.05,与对照组相比,Gli1 m RNA相对表达量显著下调(1.00±0.05;t=16.69,p<0.001)而SHH m RNA表达量变化无统计学差异(1.00±0.02;t=1.13,p=0.32);WB结果显示Gli1蛋白表达明显减少,而SHH蛋白表达无明显改变。重组质粒GSH2-sh RNA有效沉默GSH2后,RT-PCR检测GLI1、SHH m RNA相对表达量分别为0.18±0.004、0.97±0.07,与对照组相比Gli1 m RNA相对表达量显著下调(0.98±0.03;t=25.72,p<0.001)而SHH m RNA表达量变化无统计学差异(1.00±0.02;t=0.42,p=0.70);WB结果显示Gli1蛋白表达明显减少,而SHH蛋白表达无明显改变。结论:转染GSH2-siRNA可降低胰腺癌SW1990细胞的增殖、迁移、侵袭能力,可增加对吉西他滨的敏感度。转染GSH2-siRNA与GSH2-sh RNA均可减少HH信号通路关键分子GLI1的m RNA及蛋白水平的表达。第三部分胰腺癌SW1990细胞中GSH2与HH信号通路关键分子SHH及GLI1的联系目的:检测在胰腺癌SW1990细胞中GSH2与HH信号通路关键分子SHH及GLI1的联系。材料与方法:获取SW1990细胞的蛋白裂解液,采用Crosslink Magnetic Co-IP试剂盒,获取SHH及GLI1的磁珠沉淀蛋白(pulldown蛋白),并以兔Ig G为阴性对照,无处理的蛋白裂解液为阳性对照。通过免疫印迹法检测pulldown蛋白中GSH2的表达情况。结果:阳性对照中检测出GSH2、SHH、GLI1蛋白。阴性对照未检测到蛋白。SHH磁珠沉淀蛋白中检测到SHH、GSH2蛋白。GLI1磁珠沉淀蛋白中检测到GLI1、GSH2蛋白。结论:胰腺癌SW1990细胞中GSH2与SHH及GLI1存在蛋白间的相互作用。第四部分GSH2-siRNA裸鼠皮下瘤的体内实验目的:检测GSH2-siRNA对胰腺癌SW1990细胞裸鼠皮下种植瘤增殖及吉西他滨敏感性的影响材料与方法:将siRNA处理48小时后的SW1990细胞种植于裸鼠右前肢背部皮下,每只接种1x107/100 ul细胞悬液,将裸鼠随机分成A组:NC-siRNA;B组:GSH2-siRNA;C组:NC-siRNA+吉西他滨;D组:GSH2-siRNA+吉西他滨。两周后开始腹腔注射吉西他滨(100mg/kg),每3天注射一次,连续腹腔注射2周后处死裸鼠,取出皮下瘤,记录肿瘤体积,并观察腹腔及胸腔转移灶情况。结果:所有裸鼠在两周后均可成瘤,处死后腹腔及胸腔均未见转移灶。NC-siRNA组与GSH2-siRNA组的肿瘤体积无显著差异(260.1±61.25、216.6±26.64,t=0.59,p=0.572)。联合吉西他滨处理后,GSH2-siRNA组的肿瘤体积为74.4±16.19,小于NC-siRNA组(100.5±23.36,t=3.16,p=0.016)。结论:在裸鼠皮下瘤中,沉默GSH2基因可增加胰腺癌SW1990细胞对吉西他滨的敏感性。通过上述研究,本课题得出结论如下:1.GSH2基因在胰腺癌组织较癌旁正常组织中高表达。2.沉默GSH2基因可抑制胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力并提高对吉西他滨敏感性。3.胰腺癌SW1990细胞中GHS2、SHH、GLI1蛋白存在相互作用。