血吸虫病是一种由裂体血吸虫属血吸虫感染引起,严重危害人民健康、阻碍社会经济发展的人畜共患寄生虫病。血吸虫为雌雄异体的复殖吸虫,其种群繁多、分布区域重叠,不同种血吸虫尾蚴感染同一宿主体后,异种童虫在宿主体内雌雄合抱,杂交后可形成新的杂交虫株。优势杂交虫株的产生及其生物学特性如对宿主选择性、生殖力及感染力等改变,势必导致其种群演化、分布区域、流行模式及对人和动物的致病性的变化。随着全球经济一体化及国家间经贸合作迅速发展,国际人员交流频繁,血吸虫的种间杂交机会增加并已成为一种新型的公共卫生问题,因杂交株所致的血吸虫病已成为潜在的全球性疾病,引起了广泛关注。本文研究内容主要包括以下几个方面。第一部分日本血吸虫与曼氏血吸虫杂交虫株的构建目的:探讨日本血吸虫与曼氏血吸虫童虫在同一终宿主能否雌雄合抱产卵进行有性生殖、子代虫卵孵化出毛蚴感染宿主螺、幼虫在螺体内完成无性生殖,从而形成具有生殖力的杂交虫株。方法:采用单只毛蚴感染单只中间宿主螺(钉螺、光滑双脐螺)的方法,制备单性别尾蚴,分别采用雌性曼氏血吸虫尾蚴与雄性日本血吸虫尾蚴、雌性日本血吸虫尾蚴与雄性曼氏血吸虫尾蚴感染同只小鼠,收集感染鼠粪便中虫卵,孵化毛蚴分别感染钉螺和光滑双脐螺,螺按常规方法饲养25℃的实验室环境中,感染性螺逸出尾蚴再感染小鼠收集卵孵化完成生活史过程。结果:雌性曼氏血吸虫与雄性日本血吸虫杂交感染组小鼠感染后52天在粪便中出现类似曼氏血吸虫虫卵的杂交虫卵。杂交虫卵孵化出的毛蚴成功感染钉螺、光滑双脐螺,杂交株尾蚴从钉螺、光滑双脐螺中逸出的时间分别在感染后第70天、42天,从杂交株尾蚴感染宿主到产卵需要42天;雌性日本血吸虫与雄性曼氏血吸虫杂交感染组小鼠感染后46天在粪便中出现类似于日本血吸虫虫卵的杂交虫卵。杂交虫卵孵化出的毛蚴感染钉螺,杂交株尾蚴在感染后第93天从钉螺逸出,从杂交株尾蚴感染宿主到产卵需要36天。结论:日本血吸虫与曼氏血吸虫在小鼠体内合抱杂交的两个杂交虫株均可完成生活史各阶段的发育并可产生可育的子代;雌性曼氏血吸虫尾蚴与雄性日本血吸虫尾蚴、雌性日本血吸虫尾蚴与雄性曼氏血吸虫尾蚴混合感染杂交后虫卵形态学特征和毛蚴对中间宿主螺的选择性均有改变。第二部分日本血吸虫与曼氏血吸虫杂交虫株的生物学特性目的:比较雌性曼氏血吸虫尾蚴与雄性日本血吸虫尾蚴、雌性日本血吸虫尾蚴与雄性曼氏血吸虫尾蚴混合感染后所形成的两个杂交虫株生物学特性的变化,以探索杂交虫株的生物学性状的变化对血吸虫病传播的影响。方法:日本血吸虫雌雄尾蚴、曼氏血吸虫雌雄尾蚴、雌性曼氏血吸虫尾蚴与雄性日本血吸虫尾蚴、雌性日本血吸虫尾蚴与雄性曼氏血吸虫尾蚴混合定量感染小鼠,于感染20天后开始逐日收集每只小鼠排出的粪便,采用生理盐水直接涂片法检查粪便中的虫卵;待感染鼠粪便出现虫卵后,解剖小鼠收集寄生于每只小鼠肠系膜静脉、肝门静脉和肝内的血吸虫虫体,解剖镜下计数雌虫、雄虫及雌雄合抱的成虫数,计算各组血吸虫成虫的雌雄合抱率,对雌雄合抱及未合抱的成虫长度进行测量。取肝脏组织,用尼龙绢袋集卵法收集虫卵,固定后测量虫卵的大小;取新鲜虫卵进行孵化,计算虫卵的孵化率;用定量毛蚴感染钉螺和光滑双脐螺计算毛蚴对螺的感染率,观察尾蚴在螺内逸出的开放前期。结果:在终宿主小鼠体内,日本血吸虫、曼氏血吸虫粪便虫卵的开放前期分别为36.09?1.98天、44.74?1.98天,雌性曼氏血吸虫与雄性日本血吸虫感染组、雌性日本血吸虫与雄性曼氏血吸虫感染组粪便虫卵开放前期分别为54.30?2.23、48.74?2.09天。雌性曼氏血吸虫与雄性日本血吸虫感染组粪便虫卵开放前期与曼氏血吸虫组间差异有统计学意义(t=16.87 P(27)0.001));雌性日本血吸虫与雄性曼氏血吸虫感染组粪便虫卵的开放前期与日本血吸虫组间差异有统计学意义(t=21.08 P(27)0.001));雌性曼氏血吸虫与雄性日本血吸虫感染组、曼氏血吸虫卵的长度与宽度分别为122.79?8.92、59.77?5.14?m和115.21?8.75、56.24?5.49?m,虫卵的孵化率分别为2.40%,5.50%,杂交株虫卵大小显著大于曼氏血吸虫虫卵(P(27)0.01)、孵化率低于曼氏血吸虫(P(27)0.05);雌性日本血吸虫与雄性曼氏血吸虫感染组、日本血吸虫虫卵的长度与宽度分别为76.64?3.97、57.56?2.97?m和72.90?3.50、52.99?1.88?m,虫卵的孵化率分别为4.85%,5.55%,杂交株虫卵大小明显大于日本血吸虫虫卵(P(27)0.01)、孵化率低于日本血吸虫(P(27)0.05)。日本血吸虫、曼氏血吸虫、雌性日本血吸虫与雄性曼氏血吸虫、雌性曼氏血吸虫与雄性日本血吸虫感染组成虫的雌雄合抱率分别为84%、74.64%、60.85%、40.00%(P(27)0.05);日本血吸虫合抱后雌虫长度为18.87?1.66mm,未合抱雌虫成虫长度11.13?1.69mm,曼氏血吸虫合抱后雌虫长度为13.36?0.92mm,未合抱雌虫成虫长度8.26?0.94mm,同种血吸虫间合抱雌虫长于未合抱雌虫长度,差异有统计学意义(P(27)0.01);雌性日本血吸虫与雄性曼氏血吸虫混合感染4组雌雄合抱后雌虫、雄虫长度为分别为6.50?0.77、7.07?0.63mm,未合抱雌虫、雄虫6.75?0.79、7.07?0.75mm;雌性曼氏血吸虫与雄性日本血吸虫混合感染2组雌雄合抱后雌虫、雄虫长度为分别为5.40?0.91、8.17?0.89mm,未合抱雌虫、雄虫长度分别为5.36?0.80、8.07?0.75mm,异种血吸虫合抱后雌虫、雄虫长度明显短于同种血吸虫合抱(P(27)0.05),合抱与未合抱虫体长度差异无统计学意义(P(29)0.05)。雌性曼氏血吸虫与雄性日本血吸虫杂交株毛蚴既可以感染钉螺,也可以感染光滑双脐螺,感染率分别为4.61%、5.11%;雌性日本血吸虫与雄性曼氏血吸虫杂交株毛蚴只可以感染钉螺,感染率为1.44%;日本血吸虫毛蚴感染钉螺及曼氏血吸虫毛蚴感染光滑双脐螺的感染率分别为8.94%和11.33%,杂交株毛蚴的感染率低于日本血吸虫、曼氏血吸虫的感染率,差异有统计学意义(?~2=131.25,P(27)0.01)。雌性曼氏血吸虫与雄性日本血吸虫杂交株毛蚴感染光滑双脐螺及钉螺的杂交株尾蚴开放前期、曼氏血吸虫的尾蚴开放前期分别为43.38?1.19、70.14?1.79、37.36?2.16天,杂交株尾蚴开放前期与曼氏血吸虫间差异有统计学意义(P(27)0.01);雌性日本血吸虫与雄性曼氏血吸虫杂交株毛蚴感染钉螺的杂交株尾蚴的开放前期、日本血吸虫尾蚴开放前期分别为96.54?3.15、64.45?2.84天,杂交株尾蚴开放前期与日本血吸虫间差异有统计学意义(P(27)0.01)。结论:异种血吸虫成虫的雌雄合抱率低于同种血吸虫,同种血吸虫的雌雄合抱可促进雌虫发育,但对雄虫发育无影响,异种血吸虫合抱与未合抱对虫体的发育无显著差异,且雌虫、雄虫成虫的长度均明显短于同种血吸虫合抱的虫体。雌性日本血吸虫与雄性曼氏血吸虫感染组虫卵的形态与日本血吸虫虫卵相近、虫卵的孵化率降低、虫卵在粪便中开放前期长于日本血吸虫,杂交株毛蚴可以感染钉螺,杂交株毛蚴的感染率降低;雌性曼氏血吸虫与雄性日本血吸虫感染组虫卵的形态与曼氏血吸虫虫卵相近、虫卵的孵化率降低、虫卵在粪便中开放前期长于曼氏血吸虫,杂交株毛蚴既可以感染钉螺,也可以感染光滑双脐螺,杂交株毛蚴的感染率降低、杂交株尾蚴在钉螺和光滑双脐螺体内的开放前期延迟。第三部分日本血吸虫与曼氏血吸虫杂交虫株的分子标记目的:探讨合抱虫体及杂交虫株与父本母本间关系的分子学基础。方法:利用文献检索法和实验室筛选获得的血吸虫STR,针对日本血吸虫和曼氏血吸虫建立STR扩增体系,采用曼氏与日本血吸虫多重PCR反应体系,对混合感染雌雄合抱虫体及杂交株子代进行虫种鉴别;采用基因组重测序技术对杂交株子代与亲本的同源性进行分析。结果:雌性日本血吸虫与雄性曼氏血吸虫混合感染组雌雄合抱虫体中的雌虫DNA均可在日本血吸虫多重PCR反应体系被扩增,雄虫DNA均可在曼氏血吸虫多重PCR反应体系被扩增;雌性曼氏血吸虫与雄性日本血吸虫混合感染组雌雄合抱虫体中的雌虫DNA均可在曼氏血吸虫多重PCR反应体系被扩增,雄虫DNA均可在日本血吸虫多重PCR反应体系被扩增。雌性曼氏血吸虫与雄性日本血吸虫杂交株毛蚴、尾蚴及发育成的成虫均可在曼氏血吸虫多重PCR反应体系扩增,但在日本血吸虫多重PCR反应体系无扩增;雌性日本血吸虫与雄性曼氏血吸虫杂交株毛蚴、尾蚴及发育成的成虫均可在日本血吸虫多重PCR反应体系扩增,但在曼氏血吸虫多重PCR反应体系无扩增。同源性分析:雌性曼氏血吸虫与雄性日本血吸虫杂交株成虫(源于钉螺)基因组有至少1个、4个碱基覆盖的位点占日本、曼氏血吸虫基因组的百分比分别为94.49%、91.91%和2.44%、1.51%;雌性曼氏血吸虫与雄性日本血吸虫杂交株成虫(源于光滑双脐螺)基因组有至少1个、4个碱基覆盖的位点占日本、曼氏血吸虫基因组的百分比分别为2.36%、1.58%和97.20%、94.53%;雌性日本血吸虫与雄性曼氏血吸虫杂交株成虫基因组有至少1个、4个碱基覆盖的位点占日本、曼氏血吸虫基因组的百分比分别为95.45%、91.62%和2.33%、1.47%。结论:雌性曼氏血吸虫与雄性日本血吸虫、雌性日本血吸虫与雄性曼氏血吸虫混合感染组雌雄合抱虫体均分别为日本血吸虫和曼氏血吸虫。杂交株子代毛蚴、尾蚴及成虫DNA只能经其母本多重PCR反应体系被扩增。雌性曼氏血吸虫与雄性日本血吸虫杂交后源于钉螺的杂交株虫体与日本血吸虫同源性高,源于双脐螺的杂交株虫体与曼氏血吸虫同源性高;雌性日本血吸虫与雄性曼氏血吸虫杂交株虫体与母日本血吸虫同源性高。提示,日本血吸虫与曼氏血吸虫间的杂交生殖缺乏有基因交流的证据,似与孤雌生殖有关。