目的:随着社会的不断进步和发展,人类生存质量大幅提高,预期寿命不断增长,全球性人口老龄化程度也日趋增加。老年人群机体功能不断减退,各脏器生理储备功能下降,机体的脆弱性增加,维持稳态的能力下降,面对各种应激时,发病和死亡的风险大大增加。因此,深入了解衰老的生物学过程,提高生命质量,实现健康老龄化,预防衰老相关疾病的发生,不仅是生命科学、医学领域的重大科学问题,也是具有重要战略意义的社会问题。老化,是指随年龄增长个体生存及整体功能下降的过程,是正常生命进程中的一个必然阶段。随增龄发生的脑老化过程虽有各种不同的改变及表现,但认知功能减退(增龄性认知功能减退)是其最重要的特征,其机制复杂且不明确。在人体肠道中生活着100万亿个微生物,被称为肠道微生物或肠道菌群。已经发现肠道微生物的改变与许多疾病相关,包括心血管疾病、肠易激综合征(IBS)、炎症性肠病、肥胖和2型糖尿病等。来自人群研究发现,老年人群的肠道微生态发生显著改变,构成老化过程的重要机制和标志,可能影响老年人的健康水平和疾病发生。越来越多的证据表明肠道微生物参与调控大脑功能及行为,肠道菌群改变可能参与神经退行性疾病AD、PD以及精神类疾病如自闭症谱系障碍(ASD)和抑郁等的发生。也有一些报道显示肠道微生态对学习记忆的影响,包括:与SPF(Specified Pathogen Free,无特定病原体)小鼠相比,GF(Germ Free,无菌)小鼠表现为非空间记忆(新物体识别实验)的缺陷和工作记忆(T迷宫)的损伤;联合抗生素(氨苄青霉素、杆菌肽、美罗培南、新霉素、万古霉素)处理SPF小鼠,使小鼠的新物体识别记忆受损;用C.rodentium(柠檬酸杆菌)感染SPF小鼠改变肠道微生物,则导致应激诱导的记忆障碍,而在感染前使用益生菌干预能够预防感染导致的肠道微生物的改变并改善其学习记忆功能和HPA轴功能。但上述所有研究都是成年鼠在特殊实验条件如无菌(GF)鼠、致病菌感染、使用益生菌或抗生素扰乱正常菌群,观察到肠道微生态对学习记忆产生了影响。在此过程,既无衰老的过程,又无老化的生物学特征,不能反映老化条件下肠道微生态与认知功能的关联。目前尚无利用正常衰老的动物,系统观察肠道微生态对脑老化认知功能减退(增龄性认知功能减退)的作用及机制探讨的文献报道。本研究利用正常衰老大鼠及将老年大鼠的肠道菌群移植给年轻大鼠的动物模型进行三部分实验。(1)通过基于操作条件反射的延迟匹配样本任务(DMTP)和Y迷宫,观察年轻大鼠和老年大鼠认知行为差异;通过16s rRNA基因测序比较年轻大鼠与老年大鼠的肠道菌群;(2)通过粪菌移植(FMT),将老年大鼠的肠道菌群移植给年轻大鼠,观察具有了老年大鼠肠道菌群的年轻大鼠其认知行为是否改变;在此基础上,通过rs-fMRI观察FMT对不同脑区及功能连接的影响;通过电镜和Golgi染色观察FMT对突触结构及树突棘数量的影响;通过Western Blot及IHC检测FMT对NMDAR1、BDNF、GR和突触素表达量的影响;(3)慢性氧化应激损伤是引起脑老化及认知功能减退的重要机制。检测老年大鼠和具有了老年大鼠肠道菌群的年轻大鼠脑组织氧化应激水平,包括脂质氧化产物MDA的改变及机体抗氧化酶SOD、GSH-PX活性,探讨在正常老化过程中,肠道菌群是否通过氧化应激机制引起脑老化认知功能减退。本研究的结论有可能为脑老化认知功能减退(增龄性认知功能减退)的发生发展及可能机制提供新的证据。方法:第一部分观察老化引起的认知行为、脑组织形态、一些重要信号分子及肠道菌群的改变。(1)通过基于操作条件反射的延迟匹配样本任务(DMTP)和Y迷宫比较年轻大鼠与老年大鼠的认知行为。DMTP主要检测大鼠的工作记忆。DMTP包括三个阶段即样本阶段、延迟阶段和选择阶段。在样本阶段,房灯亮,实验开始,一个杆伸出(为样本杆),老鼠压杆后杆回缩,开始计时延迟。经过一定的可变延迟(0 s、2 s、4 s、8 s、12 s、18 s、24 s)后,两杆同时伸出,和样本阶段相同的杆为正确杆,选择正确则获得食物奖励。Y迷宫主要检测大鼠的空间记忆。实验分两个阶段,在训练期,用隔板挡住一个臂(此臂为新异臂),大鼠由起始臂背对迷宫的中心放入,在起始臂和其他臂自由探索10 min,然后取出;间隔1 h后,开始测试期,打开新异臂,大鼠仍由起始臂放入,在三个臂探索5 min。记录大鼠进入每个臂的次数及在每个臂的持续时间。(2)通过透射电镜观察年轻大鼠与老年大鼠海马和mPFC突触结构的改变;分析老化引起的突触结构参数的改变,包括突触间隙宽度、突触后致区(postsynaptic density,PSD)厚度和突触界面曲率。通过Golgi染色观察年轻大鼠与老年大鼠脑组织树突棘数量。(3)通过Western Blot及IHC检测年轻大鼠与老年大鼠海马和mPFC的NMDAR1、BDNF、GR及突触素的表达。(4)通过16s rRNA基因测序比较年轻大鼠与老年大鼠的肠道菌群。收集年轻大鼠与老年大鼠粪便,提取微生物组总DNA,对16s rDNA的V3、V4可变区进行PCR扩增,将获得的序列按97%相似度对可操作分类单元(Operational Taxonomic Unit,OTU)进行归并,进行Alpha多样性指数和Beta多样性分析;将OTU代表序列与Greengenes数据库的模板序列进行比对,获取各样本在门、纲、目、科、属五个分类水平上的组成和丰度,分析各样本在不同分类学水平的菌群组成。第二部分FMT将老年大鼠的肠道菌群移植给年轻大鼠,观察改变年轻大鼠的肠道菌群,对其认知行为、脑组织形态及一些重要信号分子的影响。FMT:取老年大鼠的盲肠内容物,溶于一定体积的生理盐水中,制成粪菌混悬液,800 g离心5 min,取上清获得新鲜菌液,用于FMT。接受粪菌移植的年轻大鼠,用抗生素混合液灌胃预处理3天减轻自身菌群对移植菌群的抵抗,最后一次抗生素处理24 h后,开始FMT,每天1次FMT,连续3天,之后每周2次,持续2个月,直至行为测试。通过16s rRNA基因测序确定FMT对肠道菌群的重塑;通过DMTP和Y迷宫观察FMT对认知行为的影响;通过rs-fMRI观察FMT对脑区及功能连接的影响;通过透射电镜及Golgi染色观察FMT对突触结构及树突棘的影响;通过Western Blot及IHC检测FMT对NMDAR1、BDNF、GR及突触素表达量的影响;第三部分观察氧化应激在FMT引起脑老化认知改变过程的重要作用。检测年轻与老年大鼠脑组织氧化应激水平,包括脂质氧化产物MDA的含量及机体抗氧化酶SOD、GSH-PX活性,确定老年大鼠脑组织氧化应激水平。同时检测FMT后,具有老年大鼠肠道菌群的年轻大鼠脑组织MDA含量及SOD、GSH-PX活性的改变,探讨在正常老化过程中,肠道菌群是否通过氧化应激机制引起脑老化认知功能减退。结果:(1)随月龄增加,老年大鼠出现认知功能减退。在基于操作条件反射的延迟匹配样本任务(DMTP)中,当延迟间隔为18 s、24 s时,年轻鼠的正确压杆率分别为82.43%±5.16%、77.57%±8.55%,而老年鼠的正确压杆率明显低于年轻大鼠分别为62.33%±4.40%、52.80%±5.40%(p<0.05);在Y迷宫,年轻大鼠探索新臂次数占总探索次数的比率为0.43±0.02,而老年大鼠探索新臂次数比率明显减少为0.28±0.02(p<0.01);年轻大鼠探索新臂的时间占总探索时间的比率为0.54±0.04,而老年大鼠探索新臂的时间比率明显减少为0.22±0.03(p<0.01)。同时,老年大鼠海马和内侧前额叶突触结构及重要信号分子发生改变。随增龄老年大鼠突触结构改变,包括突触间隙变宽,突触后致密区(PSD)变薄、突触界面曲率减小,树突分支减少、树突棘密度减小;海马和内侧前额叶NMDAR1、BDNF及突触素表达水平降低。这些指标可作为脑老化的检测指标。(2)随月龄增加,老年大鼠肠道微生态也发生改变。基于OTU及基于微生物类群的肠道菌群差异性分析均表明,老年大鼠的肠道菌群与年轻大鼠的明显不同,包括菌群多样性降低、优势菌迁变。老年大鼠的Shannon指数降低(p<0.05),说明老年大鼠肠道菌群多样性降低。拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)是大鼠粪便中主要的优势菌门。老年大鼠与年轻大鼠的拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门存在显著差异;在属水平,与年轻鼠相比,老年鼠Bulleidia、Collinsella、Lactobacillus、Treponema、Allobaculum、Ruminococcus、Parabacteroides水平增加,而Prevotella、Bacteroides、Sutterella、Phascolarctobacterium、Bilophila水平降低。(3)粪菌移植(FMT)改变了大鼠肠道菌群。将老年大鼠的肠道菌群移植给年轻大鼠,年轻大鼠的肠道菌群呈现“老年化”的特征,包括FMT组大鼠Shannon指数降低,多样性降低;门水平,FMT组大鼠拟杆菌门(Bacteroidetes)减少、厚壁菌门(Firmicutes)增加;属水平,FMT组大鼠Prevotella,Bacteroide,Parabacteroides,Corynebacterium,Catenibacterium,paludibacter水平降低,Adlercreutia增加,与老年大鼠接近。(4)FMT在改变年轻大鼠肠道菌群的同时,改变了年轻大鼠认知功能。在DMTP任务中,当延迟间隔为18 s、24 s时,NFMT组大鼠的正确压杆率分别为82.89%±3.86%、77.11%±6.35%,而FMT组大鼠的正确压杆率明显减少分别为58.00%±5.88%、50.55%±3.88%(p<0.05);在Y迷宫,NFMT组大鼠探索新臂次数占总探索次数的比率为0.45±0.02,而FMT组探索新异臂的次数比率明显减少,为0.34±0.02(p<0.01);NFMT组大鼠探索新臂的时间占总探索时间的比率为0.44±0.04,而FMT组探索新臂的时间比率减少为0.32±0.04(p<0.05);同时,rs-fMRI发现FMT引起海马与其他脑区功能连接发生改变;FMT引起突触结构和树突棘改变,包括突触间隙变宽、突触后致密区变薄、突触界面曲率变小、树突分支减少、树突棘密度减小;FMT引起某些重要的信号分子如BDNF、NR1及突触素表达减少。表明肠道菌群在正常脑老化认知功能减退中发挥作用。(5)氧化应激可能是FMT引起脑老化认知功能减退的重要机制。与年轻大鼠相比,老年大鼠海马和内侧前额叶MDA含量增加、SOD活性下降;通过菌群移植,具有“老年”肠道菌群特征的年轻大鼠海马和内侧前额叶MDA含量也增加、SOD活性也下降;表明在正常老化过程中,肠道菌群可能通过增加氧化损伤和抑制抗氧化酶SOD活性引起脑老化认知功能减退。结论:(1)随月龄增加,老年大鼠出现认知功能减退,突触结构改变及重要信号分子NMDAR1、BDNF、突触素表达水平降低;同时肠道菌群也发生改变;(2)通过粪菌移植(FMT)将老年大鼠的肠道菌群移植给年轻大鼠,FMT在改变年轻大鼠肠道菌群的同时,年轻大鼠出现认知功能减退,突触结构改变及重要信号分子NMDAR1、BDNF、突触素表达水平降低等一系列老年大鼠的特征。表明在脑老化认知功能减退中,肠道菌群的改变发挥了重要作用;(3)肠道微生态可能通过影响氧化应激在脑老化认知功能减退中发挥作用。