中囊胚转换(MBT)在胚胎发育过程中是一个重要的过程。从这个时期开始表达的基因将在后续的原肠胚形成及体节形成过程中起至关重要的作用。在MBT前，早期胚胎发育主要受母型mRNAs和蛋白质调控，转录水平较低。以前依靠突变的方法发现了许多重要的基因是与发育相关的。但是，还有很多在早期发育过程中具有重要功能的基因没有被发现，因为这些基因的突变会引起胚胎死亡。 本实验应用美国Affymetrix公司的斑马鱼基因表达谱芯片，对斑马鱼中囊胚转换过程中的基因表达差异进行了研究。中囊胚转换大致发生在胚胎发育至2.75hpf。分别提取发育至2.5hpf和4hpf的斑马鱼胚胎总RNA。芯片分析结果表明，共获得了479个差异表达的基因，其中360个基因表达上调，119个基因表达下调。通过GO(GeneOntology)分析表明，上调表达的基因按功能可以分为以下几种类别：信号转导，细胞通讯，表达调控，转录因子活性，胚胎发育，形态发生，性别分化，代谢以及转运类蛋白等。其中可能有一些与中囊胚转换相关并具有重要作用的基因，但其具体功能尚不清楚。选取表达上调率较高，且在中囊胚转换前末表达的31个基因作为进一步研究对象的候选者，其中部分基因已有文献报道在中囊胚转换以后的发育时期才开始表达。通过GenBank的信息分析，我们选取了BC053206(一个与线粒体运输有关的基因)和BC051620(一个Ras癌基因家族成员相似的基因)作为研究对象。随后进行PCR验证实验，证实这两个基因均在中囊胚转换以后才开始表达，与基因芯片结果一致。为了研究这两个基因的表达在空间上是否具有特异性，采用胚胎整体原位杂交技术进行了分析。结果发现，这两个基因并未在2.5hpf的胚胎中表达。当胚胎发育至4hpf的时候，这两个基因开始表达但并没有呈现区域性分布。当发育到30hpf时，这两个基因主要表达在斑马鱼的头部和体节两侧。有趣的是，与本实验室所研究的其它基因的胚胎整体原位杂交结果不同，这两个基因虽然在序列上并没有同源性，但是其表达模式极其相似。在后续的实验中，可以采用过表达和morpholine技术来研究这两个基因的功能。 斑马鱼胚胎发育到MBT后，细胞周期延长，出现G1期，这与CDK(细胞周期依赖性蛋白激酶)-cyclins复合物的调控有关，而这些复合物大多受CAK(细胞周期蛋白依赖性激酶活化激酶)磷酸化而活化。CAK的主要组成部分是CDK7、cyclinH和MATI。在斑马鱼中，CAK是否与MBT有关，目前还不清楚。本实验室已首次克隆并公布了斑马鱼cdk7和cyclinH基因的全长序列。同时为了从蛋白质水平上研究这两个蛋白的定位和相互作用关系，自制了CDK7和cyclinH两个多克隆抗体。通过构建两个表达斑马鱼cdk7(基因片段)和cyclinH(基因全长)的重组质粒，分别转化大肠杆菌BL21后进行原核表达，表达的CDK7和cyclinH两个融合蛋白均以包涵体形式存在。经SDS-PAGE电泳分离，切胶纯化获得了两个重组融合蛋白，分别免疫家兔，制备并纯化了CDK7和cyclinH两个多克隆抗体。经酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹分析检测，确定获得了两个具有较高效价的特异性多克隆抗体。利用这两个抗体进行免疫组织荧光分析，发现CDK7和cyclinH在斑马鱼shield期(6hpf)胚胎中的分布基本一致，均表达于胚胎动物极的各个细胞中。