论文部分内容阅读
β2微球蛋白（β2-microglobulin,β2M）在慢性肾衰竭患者体内不能被正常代谢,过量的β2M积累会导致淀粉样变,目前血液透析无法去除过量的β2M。纳米抗体体积小、亲和力高、免疫性强、易于融合表达,在免疫吸附治疗方面有重要的价值。因此,制备大量的抗β2M纳米抗体具有重要的临床意义,E.coli由于其低廉的培养成本和简单的操作过程,被认为是首选的制备纳米抗体的策略。抗β2M纳米抗体83F对β2M亲和力较高,结合特异性较强,但初步研究发现,其主要以包涵体形式存在。为了获得更多有活性的83F,本论文从不同宿主、不同融合标签表达及优化包涵体复性条件等多方面进行了研究。具体研究内容如下:（1）抗β2M纳米抗体83F的载体构建及表达:通过基因重组技术,将抗β2M的纳米抗体83F基因序列克隆入pET29a、pET32a、pET39b、pET40b、pET41a及pET28a、,成功构建了6种重组质粒并转化至E.coli Shuffle T7（DE3）、E.coli OrigamiTM2（DE3）、E.coli BL21（DE3）中,均获得稳定表达。通过对表达条件进行优化,发现83F在E.coli Shuffle T7（DE3）和E.coli BL21（DE3）内的表达量要明显优于E.coli OrigamiTM2（DE3）;添加融合标签可以提高83F的表达量;37℃诱导表达量高于18℃诱导。（2）抗β2M纳米抗体83F的可溶性分析:纳米抗体在18℃的低温条件下诱导表达,得到的可溶蛋白较多,其中以E.coli Shuffle T7（DE3）为宿主,以pET39b和pET40b为载体的可溶表达量最高,分别占上清表达量的14%、16%,每升TB培养基可得到纯度分别为93%和95%纳米抗体62 mg和77 mg;通过ELISA和SPR定性、定量测定纳米抗体亲和活性,结果表明融合表达的纳米抗体S39和S40均与抗原有较高的结合活性,平衡解离常数分别为1.1318×10-6M和3.457×10-7M;以pET40b为载体表达纯化后的纳米抗体切除融合标签后,SPR检测表明,其平衡解离常数为2.529×10-7M,切除标签前后,纳米抗体亲和力接近。（3）抗β2M纳米抗体83F的包涵体复性:37℃诱导温度下,以E.coli BL21（DE3）为宿主,以pET29a为载体的包涵体表达量最高,占沉淀表达量的62%。对包涵体进行稀释复性,优化得到最适宜的复性条件为:初始蛋白浓度0.4 mg/ml、20 mM Tris-HCl（pH8.0）复性缓冲液含有200 mM精氨酸、还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽比例为1:2和12.5 mM 2,6-二甲基-β-环糊精,滴加速度3 ml/min,在4℃条件下静置16 h;最终可从1 L TB培养基中获得复性后纳米抗体83F 1221 mg,纯度可达95%。圆二色光谱检测证明添加合适添加剂后,有利于纳米抗体二级结构的正确形成,在4℃条件下静置16h后,复性蛋白与上清中蛋白的二级结构以及平衡解离常数相似,说明复性后蛋白与抗原有较高的结合活性,并且具有正确的二级构象。总之,本文以E.coli为宿主,成功制备了抗β2M纳米抗体83F,一方面对原始纳米抗体通过添加融合标签,提高了纳米抗体的总表达量及可溶表达量;另一方面通过对包涵体稀释复性条件的优化,成功复性了包涵体,但比较分析发现包涵体复性的方法制备纳米抗体83F的成本较低。