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研究背景与目的慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种以Ph染色体和(或)BCR-ABL~+为特征的骨髓增生性疾病。BCR-ABL融合基因表现出高酪氨酸激酶活性并激活PI3K/Akt、MAPK、和STAT5等不同的信号途径,并最终促进慢性粒细胞增殖抑制其凋亡。近年来,酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)的使用已经明显改善了CML病人的预后,但仍有15-20%的患者出现耐药情况。耐药性仍然是CML患者实现无治疗缓解(treatment-free remission,TFR)的主要障碍。已有大量的研究报道了可能导致伊马替尼耐药的因素,其中包括ABL激酶结构域的点突变,BCR-ABL基因的过表达、扩增、和克隆化等等。耐药性的出现严重影响CML治疗的疗效。因此,我们迫切需要寻找新的治疗靶点以克服TKI耐药性。近年来,miRNAs被认为与许多癌症的进展以及耐药性密切相关,其中包括CML。已有文献报道异常表达的miR-221与CML进展密切相关。Ihle等研究发现miR-221可通过调节KIT/AKT途径诱导胃肠道间质瘤细胞凋亡。并且Dentelli等也发现miR-221可通过靶向调节STAT5表达影响乳腺癌细胞增殖。然而,在CML中,miR-221与CML耐药性产生的关系以及miR-221与STAT5之间潜在的作用机制均未完全了解。基于以上研究背景,本课题检测了CML非耐药细胞株K562和耐药细胞株K562/G中miR-221、STAT5的表达情况。我们根据CML病人标本和CML细胞株在体内和体外分别研究了miR-221、STAT5的表达情况与IM耐药性之间的关系。从而对CML的耐药机制进行更深一步的研究,探讨miR-221及miR-221-STAT5轴在其中的潜在作用,为CML患者探寻新的治疗靶点提供科学依据。方法(1)通过药物梯度诱导法,利用CML非耐药细胞株K562构建耐药细胞株K562/G。(2)按照细胞转染操作说明,使用Lipo 2000转染试剂对细胞进行转染,在转染48h或72h后,可通过qRT-PCR和western blot等方法检测细胞的转染效率。(3)通过qRT-PCR检测miRNA和靶基因mRNA的表达水平,以U6和GAPDH作为内参。通过western blot检测靶基因的蛋白表达水平,以β-actin作为内参。(4)利用凋亡芯片(Ray Biotech,Inc.,Norcross,GA)检测miR-221过表达之后基因蛋白谱的改变。并通过MaPix Microarray Scanner软件检测每个基因荧光信号强度的改变。同时利用AAH-APO-G1分析软件进行相关数据分析。(5)用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况;用Annexin V/PI双染试剂盒检测细胞凋亡情况,并通过流式细胞术对其结果进行分析。(6)为了验证miR-221的直接作用靶点,我们构建双荧光素酶报告质粒载体,并将miR-221模拟物和对照物分别转染K562/G细胞。转染48h后,观察实验组和对照组荧光表达差异。(7)收集接受化疗的慢性期CML病人标本35例,健康人标本31例。通过qRT-PCR技术分别检测miR-221的表达水平。结果(1)qRT-PCR实验结果显示,IM耐药的CML细胞株miR-221的表达水平明显低于IM敏感的CML细胞株(P<0.001);IM治疗失败的CML病人标本中,miR-221的表达水平也显著低于IM敏感的CML病人(P<0.001)。(2)在耐药细胞株K562/G中过表达miR-221可增强其对IM的敏感性,并可抑制其增殖(P<0.5),促进其凋亡(P<0.01)。并且加入IM治疗后,实验组的凋亡率也明显高于对照组(P<0.001)。(3)我们通过凋亡蛋白芯片结果发现当过表达mi-221后,有27个与凋亡相关的蛋白发生明显的改变。促凋亡蛋白Caspase3(P<0.01)和Bax(P<0.5)的表达明显增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低(P<0.5)。我们通过western blot对芯片结果进行验证,也得出相同的结论。(4)STAT5B是miR-221的直接作用靶标。双荧光素酶报告载体结果表明当加入miR-221模拟物时,STAT5B野生型荧光素酶活性明显降低(P<0.01),而STAT5B突变型的荧光素酶活性无明显改变。(5)miR-221通过靶向调控STAT5B表达促进CML细胞凋亡抑制其增殖。无论在未加IM(P<0.5)或加入IM(P<0.5))时,抑制STAT5B的表达均可促进细胞凋亡。并且抑制STAT5B表达可使Bax表达增加,使Bcl-2表达降低(P<0.5),同时抑制细胞增殖(P<0.5)。结论总的说来,我们的研究结果表明miR-221可能是调节CML化学敏感性的关键调节因子。我们目前的研究结果可以为CML的治疗提供新的实验数据,并且发现miR-221-STAT5轴这个新的治疗靶标。miR-221-STAT5调控抽可能在CML潜在的靶点治疗中发挥重要作用并且在ABL KD突变的上游调控机制中也发挥重要作用。然而,miR-221在CML中的具体的分子调节机制尚不确定,我们会在在未来的研究中进一步研究探讨。