研究基础梗阻性黄疸(obstructive jaundice,0J)是一种肝胆外科常见临床病理综合征,近年来,大量基础研究发现0J导致的肠黏膜屏障功能损伤和肝网状内皮细胞功能障碍,是细菌/内毒素移位的关键,也是0J病人多脏器功能障碍的重要诱发因素。0J时,构成肠道屏障功能的机械屏障、免疫屏障、生物屏障以及化学屏障等均受到不同程度损害,导致肠粘膜通透性增高,内毒素吸收入血增加；同时肠道内毒素的清除能力下降；加之肠道微生态动态平衡破坏,细菌移位也更易发生,最终发生肠源性内毒素血症,继而诱发全身多器官功能损害。目前针对0J机体全身多脏器功能损害始动因素的研究,主要着眼点集中在肠粘膜屏障功能障碍,以及细菌/内毒素经门脉系统移位并扩散至全身,形成内毒素血症等情况的探讨。近年研究证实,肠粘膜屏障功能受损,LPS等与肠上皮细胞直接接触,可以激活肠上皮及肠道相关淋巴组织,导致肠源性细胞因子和其它炎症介质的释放,经淋巴途径进入体循环,造成机体损伤。检索国内外相关资料,针对0J机体中关于非细菌性、肠源性组织损伤因子的阐述较少,特别是对肠源性物质移位至体循环的另一重要途径“肠-淋巴途径”,在0J机体中的变化及意义等方面的研究更为少见。高迁移率族蛋白1(HMGB1),近年作为一种重要的晚期炎症介质得到深入研究。一方面其可由单核细胞、巨噬细胞等激活的免疫细胞、肠上皮细胞等多种有核细胞主动分泌；再者也可从坏死或损伤的细胞中被动释放到细胞外或外周血循环,这表明HMGB1既是炎症的早期启动者(部分坏死细胞被动释放HMGB1),更是晚期炎症的促进者(巨噬细胞等主动分泌HMGB1)。在HMGB1受体及信号转导途径中,除了晚期糖基化终末产物受体(RAGE)以外,Toll样受体(TLRs)也是HMGB1的另一类重要家族受体,近来研究证实其作为TLR-2/4等重要的内源性配体,两者相互结合后可进一步通过MyD88等多种通路激活核转录因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB),促进细胞因子和其他炎症介质的表达,导致炎症反应的发生。动物模型及部分临床研究均表明,HMGB1在许多疾病如脓毒血症、肺脏急性炎症损伤、肠道、肝脏炎症、关节炎、心血管疾病及许多自身性免疫疾病的发生和发展过程中都起到了重要作用。机体发生梗阻性黄疸时同样伴有肝脏、肺脏及肾脏等全身多脏器功能损害,但目前在0J机体所致肠损伤中,HMGB1的表达变化研究极少。ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acids, ω-3 PUFA)作为一种重要的免疫肠内营养制剂,大量体内外研究[42-47]证实：ω-3 PUFA可通过抑制免疫细胞增殖及活化、减少促炎细胞因子的产生、抑制粘附分子表达、影响抗原提呈等多种途径发挥免疫调节效应。动物实验及临床研究证实ω-3 PUFA在多种病理生理过程中均发挥积极作用；如上述,ω-3 PUFA是否也可调节0J机体中HMGB1的表达水平改变,通过TLR途径调节机体炎症反应仍是未知。这个问题值得我们进一步探讨。为此,本课题首先建立0J动物模型,予以应用富含ω-3多不饱和脂肪酸的鱼油干预,并行腹部胸导管置管引流淋巴液,通过对外周血液、淋巴液中细胞因子(TNF-α、IL-1β及IL-10)、 NO及HMGB1测定,明确ω-3 PUFA干预的影响；推测上述细胞因子或炎症介质的可能来源。进一步对比分析肠粘膜组织中HMGB1与Toll样受体-4(TLR4)及NF-κB蛋白表达变化,明确“肠—淋巴途径”及HMGB1等在0J导致肠屏障功能损害中的作用,然后应用富含ω-3 PUFA处理,进一步探讨ω-3多不饱和脂肪酸对0J机体保护作用的可能机制。第一部分：ω-3 PUFA干预梗阻性黄疸大鼠血液及淋巴液中细胞因子对比观察目的：1.改良腹部胸导管置管过程,建立简洁的淋巴管置管及淋巴液引流的方法。2.对比观察血液及淋巴液中TNF-α、IL-1β、IL-10、NO及HMGB1含量变化,以及ω-3 PUFA干预后的影响。方法：SPF级雄性wistar大鼠72只,随机分为：梗阻性黄疸(0J)组(n=24),梗阻性黄疸+ω-3 PUFA组(OJPUFA)组(n=24)及Sham组(n=24)。根据标本收集时间的不同,再次随机分为d3、d7及d14三组。梗阻性黄疸模型通过胆总管双重结扎法建立,仅OJPUFA组动物自术后第1天,给予ω-3PUFA按0.4g. kg-1.d-1剂量灌胃,其余组动物相应时间点等量生理盐水灌胃作为对照。各组大鼠分别于术后第3、7、14天腹部胸导管置管收取淋巴液,以及下腔静脉血液、回肠组织等标本,分别予以置-80℃冰箱或10%中性甲醛固定后保存。利用全自动生化分析仪检测总胆红素(TBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)等生化指标。ELISA测定TNF-α、IL-1β、IL-10及HMGB1含量,硝酸还原酶(微板法)测定NO含量。采用SPSS16.0统计软件进行统计分析,计量资料以mean±SD表示,计量资料先进性正态性检验(Shapiro-Wilk),所有参数均符合正态分布。两样本均数的比较采用两独立样本t检验；组间均数的比较应用单因素方差分析(one-way ANOVA),对于方差分析显著,且满足方差齐性要求的多重比较,应用LSD法(least significant difference,最小显著差值法)检验；不满足方差齐性要求的多重比较,应用Dunnett’s T3法检验；统计图用SigmaPlot 10.0绘制。按检验水准α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.通过充分游离腹主动脉间接显露腹部胸导管,操作过程简单,置管成功率高,收集淋巴液量相对较大,能满足后续实验要求。2.一般情况：本实验所有动物均未发生术后切口感染或切口裂开等并发症,实验过程中OJl4d组死亡1只(肠梗阻),余无动物死亡。0J与OJPUFA组大鼠术后第1-3天,体重有下降趋势,7天以后均恢复至术前体重,但任一相同时间点,较Sham组体重明显减低；d14时间点时OJPUFA组大鼠体重高于0J组,且差异有显著性(P=0.000<0.05),但都显著低于Sham组(P<0.05)。3.肝脏功能指标变化：Sham组TBIL及DBIL水平在整个实验过程中没有明显变化,0J组与OJPUFA组血清TBIL及DBIL水平自术后第3日起较Sham组明显增高,但该两组之间相比差异均无显著性(P=0.786,0.790,0.881>0.05),(P=0.855,0.324,0.530>0.05)。Sham组ALT及AST水平在整个实验过程中波动幅度较小。0J组与OJPUFA组中血清ALT及AST水平,自术后第3天起较Sham组明显增高,但差异无显著性,随时间推移,此二者血清水平均成进行性升高趋势,至术后14天,0J组ALT及AST均显著高于OJPUFA组(P=0.014,0.012<0.05)。4.血清及淋巴液中TNF-α的变化：假手术组大鼠血清及淋巴液中TNF-α水平随时间延长,逐渐下降,至14d降至最低点。与Sham相反,0J组和OJPUFA组大鼠血清及淋巴液中TNF-α含量均在第7d时达到最高值,然后下降,但在相同的检测时间,均显著高于假手术组。OJPUFA组血清及淋巴液中TNF-α浓度均低于0J组水平,在d14时间点显著低于0J组(P=0.014<0.05)。Sham组大鼠血清及淋巴液中,TNF-α的含量相近,差异无显著性(P>0.05)。而在任一相同时间点,0J组和OJPUFA组大鼠淋巴液中TNF-α的浓度,均显著高于相对应组别内血清含量水平(P<0.05)。5.血清及淋巴液中IL-1β的变化：Sham组大鼠血清及淋巴液中IL-1 β水平在术后逐渐下降,至14d时水平最低。0J组和OJPUFA组大鼠血清及淋巴液均在d14时达到最高值,且在任一相同时间点,均显著高于假手术组。在第14d时0J组IL-1β浓度绝对值水平显著高于OJPUFA组(P=0.020<0.05)。0J组与OJPUFA组淋巴液IL-1β含量变化与血清含量变化趋势相似,在7d及14d两个时间点,OJPUFA组内浓度均显著低于0J组(P=0.019,0.000<0.05)。Sham组大鼠血清及淋巴液中,IL-1β含量相似。在d 3、d7时间点,0J组和OJPUFA组大鼠淋巴液中IL-1β的浓度,均显著高于血清内的含量(P<0.05)。6.血清及淋巴液中IL-10的变化：0J组和OJPUFA组大鼠血清及淋巴液中IL-10含量均显著高于假手术组,且均呈现进行性升高趋势,以0J组升高更为显著。在d14时间点,0J组血清IL-10水平显著高于OJPUFA组(P=0.016<0.05)。淋巴液中IL-10含量,在术后任一相同时间点0J与OJPUFA组无显著性差异(P=0.657,0.708,0.246>0.05)。在3d、7d时间点,血清IL-10的含量显著高于淋巴液水平(P<0.05)。在14d时间点,血清中工L-10的水平仍高于淋巴液含量,但差异无显著性(P>0.05)。7.血清及淋巴液中HMGB1的变化：Sham组大鼠血清及淋巴液中HMGB1水平逐渐降低。0J组和OJPUFA组大鼠血清及淋巴液中HMGB1含量均显著高于假手术组。在d7及d14,OJPUFA组血清HMGB1水平显著低于0J组(P=0.008,0.002<0.05)。在d14时间点OJPUFA组大鼠淋巴液中HMGB1含量显著低于0J组(P=0.031<0.05)。Sham组内血清及淋巴液中HMGB1水平差异无显著性。在d3及d7两个时间点,0J组和OJPUFA组大鼠血清中HMGB1的水平高于淋巴液中的含量,但差异无显著性(P>0.05)。随后,淋巴液中HMGB1的含量升高更为迅速,d14时间点,淋巴液中HMGB1的水平即显著高于血清含量(P<0.05)。8.血清及淋巴液中NO的变化：在任一时间点,0J组和OJPUFA组血清及淋巴液中NO水平均显著高于Sham组。在d7、d14时间点,OJPUFA组血清NO水平显著低于0J组(P=0.032,0.021<0.05)。在d14时间点,0J组淋巴液中NO水平显著高于OJPUFA组(P=0.002<0.05)。相同时间点、相同组别,血清及淋巴液中NO含量对比分析提示,两者之间无显著性差异(P<0.05)。研究结论：1.通过充分游离腹主动脉来间接显露腹部胸导管,符合此二者之间的解剖关系,更有利于胸导管显露,创伤减少,操作简单,淋巴液引流量相对较大,可用于需要开腹手术的大鼠疾病模型中引流淋巴液的研究。2.ω-3多不饱和脂肪酸干预后,在一定程度上改善了大鼠体重及肝脏功能,但在胆道梗阻未解除的前提下,ω-3 PUFA干预对大鼠一般情况及肝脏功能的改善等方面作用是有限的。3.ω-3多不饱和脂肪酸干预,能减弱促炎因子HMGB1、TNF-α及IL-1β的释放,避免IL-10水平过度升高,改善0J机体免疫紊乱状态,减弱机体大量分泌NO所介导的损害反应。4. TNF-α及IL-1β可能主要来源于0J机体肠道淋巴等组织的分泌；淋巴液中IL-10及NO可能不是0J机体的主要来源。而HMGBl在胆道梗阻后早期,淋巴液中的HMGBl可能不是机体的主要来源,但随梗阻时间延长,肠道淋巴等组织的分泌增加更为显著。第二部分：ω-3PUFA对梗阻性黄疸大鼠小肠损伤的影响及机制目的：观察ω-3 PUFA对梗阻性黄疸大鼠回肠形态学及杯状细胞数量变化的影响；以及HMGB1/TLR4信号转到途径在0J损害中的作用及可能机制。方法：本研究第一部分留取的回肠标本,应用于本实验研究。HE及AB-PAS染色观察肠粘膜形态学及杯状细胞变化；免疫组织化学染色观察HMGB1、TLR4及NF-Kbp65在肠粘膜表达变化；qRT-PCR及Western-blot检测回肠组织HMGB1、 TLR4及NF-Kb p65 mRNA及蛋白表达变化。统计学方法同第一部分。结果：1.肠道组织病理学变化假手术组：肠绒毛结构清晰,无充血水肿,间质内无明显炎性细胞浸涧,上皮细胞完整。0J组：自d3开始,粘膜绒毛水肿逐渐加重,间质可见充血,炎性细胞浸润逐渐增多,绒毛之间的间隙逐渐增大,粘膜高度逐渐降低,腺窝深度变浅,开口逐渐增宽,绒毛长度与腺窝深度的比例逐渐降低,在d14时间点,绒毛显著缩短,可见部分绒毛上皮细胞脱落缺失明显,部分区域溃疡形成。OJPUFA组,在d3、d7时间点,肉眼观无明显差别,至d14时间点可见绒毛粗短,但结构相对完整,绒毛脱落及溃疡形成少见。对第14天,小肠绒毛高度、隐窝深度以及二者的比值进一步对比可见,假手术组绒毛高度显著高于0J组及OJPUFA组,且以0J组降低更为显著,与OJPUFA组相比(P=0.000<0.05)；在隐窝深度方面的变化趋势与绒毛高度变化趋势相近；而对于绒毛高度/隐窝深度比值方面,假手术组显著高于0J组及OJPUFA组(P<0.05),差异有显著性。尽管OJPUFA组高于0J组,但二者比较无显著性差异(P=0.107>0.05)。2. AB-PAS染色显示回肠杯状细胞吸光度值变化Sham组大鼠中,小肠杯状细胞呈蓝染,均匀分布于肠黏膜上皮内,细胞饱满,在各时间点无明显差异。而0J组和OJPUFA组大鼠,肠绒毛水肿显著,在d3时间点杯状细胞吸光度值稍高于假手术组,在d7、d14时间点杯状细胞数量明显减少,均显著低于任一相同时间点假手术组含量,且0J组下降更为明显,在d14时间点,显著低于OJPUFA组水平(P=0.035<0.05)。3.回肠组织中HMGB1, TLR4及NF-κb p65蛋白表达变化(免疫组织化学染色及Western-blot定量)3.1 HMGB1Sham组大鼠肠粘膜上皮细胞内仅见少许淡黄色颗粒,在任何时间点表达均不显著。而0J和OJPUFA组在d3时间点就可见显著黄染,染色阳性区域主要位于绒毛顶端,主要位于肠粘膜上皮细胞核内,胞浆内表达少,同时间质中的炎症细胞也可见阳性表达。d7时间点,0J组整个绒毛上皮细胞的胞核及胞浆均可见明显黄染,间质中的炎症性细胞的表达量亦明显增加；而OJPUFA组的阳性表达主要位于细胞核内,也呈现弥漫性表达增强。在d14时间点,在0J组中HMGB1表达也显著增强,肠粘膜上皮细胞胞核、胞浆甚至胞外都可见明显棕黄色乃至棕褐色颗粒沉着,间质中的炎症细胞也呈现相同的染色结果。OJPUFA组也有相似变化趋势,但染色程度明显变浅。Western-blot检测提示,Sham组大鼠HMGB1始终维持于较低水平,与0J组及OJPUFA组相比,显著降低(P<0.05),d3时间点开始,0J组和OJPUFA组大鼠小肠内HMGB1的含量均显著高于假手术组,以0J组变化最为显著,第14d时,0J组小肠内HMGB1水平即显著高于OJPUFA组(P=0.001<0.05)。3.2 TLR4Sham组大鼠肠粘膜上皮细胞膜表面未见明显黄染。0J和OJPUFA组在d3时间点就可见少许黄染,位于绒毛顶端,在d7时间点,0J组肠上皮细胞膜表面可见明显黄染,间质中的炎症性细胞也可见少许阳性表达；在d14时间点,0J组肠绒毛顶端细胞膜显著黄染,致部分上皮细胞膜清晰可见；而OJPUFA组阳性表达程度明显弱于0J组。Western-blot显示,Sham组大鼠TLR4始终维持于较低水平,与免疫组化染色结果一致。d3时间点开始,0J组和OJPUFA组大鼠小肠内TLR4的含量均显著高于假手术组,且表达量逐渐增多,0J组变化最为显著。在d14,0J组小肠内TLR4的水平即显著高于OJPUFA组(P=0.000<0.05)。3.3 NF-κb p65Sham组大鼠肠粘膜上皮细胞核内仅见少许淡黄色颗粒,0J组和OJPUFA组在d3、d7时间点,细胞核内可见显著黄染,染色阳性区域弥漫分布于整个绒毛,阳性表达主要位于肠粘膜上皮细胞核内,胞浆内表达少,间质中的炎症细胞也可见阳性表达。在d14时间点,0J组肠粘膜上皮细胞的胞核及胞浆内均可见明显黄染甚至棕褐色颗粒,并呈片状连续性、强阳性表达,整个绒毛及隐窝区内上皮细胞胞浆及胞核均可见明显黄染,并且间质中炎症细胞的表达量也明显增加。而OJPUFA组的阳性表达主要位于细胞核内,也呈现弥漫性表达增强,胞浆阳性表达程度相对较弱,间质中炎症细胞胞核及胞浆也有阳性表达。Western-blot相对定量结果显示,Sham组大鼠NF-κb p65始终维持于极低水平,d3时间点开始,0J组和OJPUFA组NF-κb p65的含量均显著高于假手术组,均呈现进行性升高趋势,且以0J组变化最为显著,在d7、14d两个时间点,0J组小肠内NF-κb p65水平即显著高于OJPUFA组(P=0.007,0.000<0.05),这与免疫组织化学染色结果一致。4.回肠组织中HMGB1mRNA, TLR4 mRNA及NF-κb p65 mRNA的表达变化与Sham组相比,0J及OJPUFA组大鼠以上各基因表达水平明显增加。在d3时间点,0J组与OJPUFA组相比,各基因表达水平无明显差异。在d7、d14时间点,0J组HMGB1mRNA表达水平显著高于OJPUFA组(P=0.010,0.000<0.05)。而在d7时间点,0J组与OJPUFA组相比,TLR4 mRNA (P=0.335>0.05)及NF-κbp65mRNA (P=0.550>0.05)表达水平无明显差异。随梗阻时间延长,在14d时0J组小肠内TLR4 mRNA及NF-κb p65 mRNA表达水平即显著高于OJPUFA组(P=0.000,0.019<0.05)。结论：ω-3PUFA可改善梗大鼠阻性黄疸导致的肠绒毛高度减退,改善绒毛高度／隐窝深度比值,减弱梗阻性黄疸机体中肠粘膜上皮的损害,并可改善肠粘膜上皮中杯状细胞的数量和功能。梗阻性黄疸可促进大鼠肠管组织中HMGB1/TLR4/NF-κB通路的活化,损害肠粘膜屏障功能；ω-3多不饱和脂肪酸可能通过抑制该通路而发挥对肠粘膜的保护作用。