论文部分内容阅读
鸡球虫病是集约化养鸡场最常见的禽病之一,除引起发病死亡外,还可导致饲料报酬降低和胴体质量下降等其他损失,估计每年全球因球虫病的损失为8亿美元,我国每年仅抗球虫药的消费约0.3-0.6亿美元。目前,该病的防控措施正由药物转向免疫预防转变。配子体抗原亚单位疫苗是国外上市的一种新型鸡球虫病疫苗,是由巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)配子体分离纯化的3种蛋白(EmGam56、EmGam82、EmGam230)配制而成。由于生产该类疫苗需从感染鸡体的肠道上皮细胞中分离配子体,然后经亲和层析柱分离纯化配子体蛋白,因此生产过程复杂,成本也较高。所以研制成本低廉的原核表达亚单位疫苗有着诱人的前景。为此,本研究对E. maxima配子体Emgam56全长基因进行了原核表达,分析了重组蛋白rEmGam56的免疫原性,同时制备了重组蛋白rEmGam82-Y,并通过动物免疫保护试验评价了重组蛋白对E. maxima的免疫保护作用。旨在为重组配子体抗原亚单位疫苗的研制奠定基础。1.巨型艾美耳球虫Emgam56全长基因的原核表达与免疫原性分析根据Emgam56基因去除信号肽后的ORF序列和质粒pET-28a (+)的酶切位点设计一对特异性引物,以本实验室保存的重组质粒pGEM-T-Emgam56为模板,PCR扩增出目的片段,插入质粒pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28-Emgam56。测序正确后转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,融合蛋白在大肠杆菌中成功表达。表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在,大小约为56KDa。分别以鼠抗重组蛋白rEmGam56多克隆抗体和E. maxima鸡康复血清为一抗进行Western-blot检测,结果显示重组蛋白具有良好的免疫原性。2.巨型艾美耳球虫重组蛋白rEmGam82-Y的制备将本实验室构建保存的pGEX-6P-1-gaw82-Y质粒重新转化入BL21表达菌中,融合蛋白在大肠杆菌中成功表达,表达产物主要以包涵体的形式存在,大小约为53KDa。在本实验室原有的技术基础上,对包涵体纯化过程进行了改进,使包涵体纯化率达到90%以上,浓缩后重组蛋白浓度达到3mg/mL。3.巨型艾美耳球虫重组蛋白rEmGam56的免疫保护效果为研究重组蛋白rEmGam56对鸡的免疫保护效果,以死亡率、相对增重率、病变记分减少率、卵囊减少率等作为评价指标,并与重组蛋白rEmGam82-Y和卵囊免疫相比较。结果显示,重组蛋白rEmGam56高剂量组(300μg)的平均增重和相对增重率高于中剂量组(200μg)和低剂量组(100μg),与重组蛋白rEmGam82-Y高剂量组(300μg)的相近,但低于卵囊免疫组,差异显著(P<0.05)：重组蛋白rEmGam56高剂量组的平均病变记分低于中剂量组和低剂量组,与重组蛋白rEmGam82-Y高剂量组的相近,但高于卵囊免疫组,差异显著(P<0.05)；重组蛋白rEmGam56高剂量组的病变记分减少率高于中剂量组和低剂量组,与重组蛋白rEmGam82-Y高剂量组的相近,但低于卵囊免疫组。结论：重组蛋白rEmGam56对于E. maxima感染有一定的免疫保护作用,但低于活卵囊免疫。4.巨型艾美耳球虫重组蛋白rEmGam56与rEmGam82-Y的联合免疫保护效果为研究重组蛋白rEmGam56与rEmGam82-Y联合免疫对鸡的保护效果,以死亡率、相对增重率、病变记分减少率、卵囊减少率等作为评价指标,并与重组蛋白rEmGam56免疫、重组蛋白rEmGam82-Y免疫和卵囊免疫相比较。结果显示,重组蛋白rEmGam56(150μg)与rEmGam82-Y(150μg)联合免疫的平均增重和相对增重率高于重组蛋白单独免疫组,但低于卵囊免疫组,差异显著(P<0.05)；重组蛋白rEmGam56与rEmGam82-Y联合免疫组的平均病变记分低于重组蛋白单独免疫,但高于卵囊免疫组,差异显著(P<0.05)；重组蛋白rEmGam56与rEmGam82-Y联合免疫组病变记分减少率高于重组蛋白单独免疫组,但低于卵囊免疫组。结论：重组蛋白rEmGam56与rEmGam82-Y联合免疫对鸡的保护效果要好于重组蛋白单独免疫,但低于活卵囊免疫。5.不同免疫佐剂对重组蛋白rEmGam56免疫保护效果的影响为研究白细胞介素-2(IL-2)、细胞转移因子、黄芪多糖(APS)作为免疫佐剂对重组蛋白rEmGam56免疫保护效果的影响,以死亡率、相对增重率、病变记分减少率、卵囊减少率等作为评价指标,并与弗氏佐剂、空佐剂(重组蛋白单独)和卵囊免疫相比较。结果显示,平均增重、相对增重率和病变记分减少率按白细胞介素-2、细胞转移因子、黄芪多糖、弗氏佐剂、空佐剂依次减少,重组蛋白免疫组平均增重显著低于卵囊免疫组差异(P<0.05)；平均病变记分按白细胞介素-2、细胞转移因子、黄芪多糖、弗氏佐剂、空佐剂依次增高,与卵囊免疫组的差异显著(P<0.05)。结论：白细胞介素-2、细胞转移因子和黄芪多糖在一定程度上能增强重组蛋白rEmGam56的免疫保护作用。