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第一部分Tp73在酒依赖大鼠认知功能障碍中的作用背景酒依赖（Alcohol Dependence,AD）是一种由于长期饮酒而导致的精神疾病,为仅次于心血管疾病和肿瘤位居第三的全球性公共卫生问题。酒依赖导致的注意力分散、记忆力衰退等认知功能障碍是目前酒依赖治疗的关键问题。海马是认知功能相关的重要脑区,也是酒精作用于大脑的一个重要区域。Tumor protein 73（Tp73）属于Tp53家族,与细胞凋亡密切相关,在神经发育中发挥重要作用;但其与酒依赖导致的认知功能障碍的关系却鲜有报道。目的探究酒依赖模型大鼠中Tp73的变化及认知功能的改变;分析酒依赖导致的认知功能障碍与Tp73的关系。方法1.选择SPF级Wistar雄性大鼠30只。将大鼠随机分为对照组（Con）和酒依赖组（AD）,AD组大鼠腹腔注射10%（w/v）酒精溶液,剂量为1g/kg/d;Con组注射等体积的生理盐水,两组大鼠进行条件位置偏爱（Conditional place preference,CPP）训练,制备酒依赖大鼠模型。2.利用旷场实验、高架十字迷宫实验、新物体识别实验及Y迷宫实验测试对两组大鼠进行行为学检测,观察其认知功能、情绪及运动能力变化情况;利用尼氏染色技术检测两组大鼠海马神经元形态结构变化;利用蛋白免疫印迹技术检测Tp73、凋亡相关分子表达水平。3.选取Wistar雄性大鼠36只,随机分为3组,每组12只,即siRNA对照病毒组（Con+Con-AAV,CCA）、酒依赖+siRNA对照病毒组（AD+Con-AAV,ACA）和酒依赖+Tp73 siRNA病毒组（AD+AAVi-Tp73,AAT）,每组12只。使用脑立体定位注射技术向大鼠海马CA1、CA3注射Tp73-siRNA或对照siRNA腺相关病毒。病毒处理21天后,对各组大鼠进行CPP训练。之后通过旷场实验、高架十字迷宫实验、新物体识别及Y迷宫实验检测各组大鼠的认知功能、情绪及运动能力变化情况;利用尼氏染色技术检测三组大鼠海马神经元形态结构变化;利用蛋白免疫印迹技术检测TP73及凋亡相关分子表达水平。结果1.酒依赖模型大鼠行为学、病理学及分子生物学检测（1）行为学结果显示:Con组与AD组大鼠两组基值无差异（P＞0.05）。与Con组相比,AD组大鼠CPP测试值及分值明显升高（均P＜0.05）,说明AD组出现了明显的CPP效应,酒依赖大鼠模型构建成功。与Con组相比,AD组大鼠新物体识别实验中辨别指数显著减少（P＜0.05）,旷场实验中运动总距离显著减少（P＜0.01）,高架十字迷宫进入开放臂的时间及次数降低（P＜0.05）,Y迷宫实验中对新异臂的探索时间减少（P＜0.01）。（2）尼氏染色结果显示:与Con组相比,AD组海马CA1区和CA3区神经元数量减少（均P＜0.05）,胞体排列疏松,染色苍白,但DG区无明显变化。（3）蛋白结果显示:与Con组相比,AD组造模后海马、前额叶皮质、纹状体Tp73蛋白水平均显著增高（均P＜0.05）。海马脑区中Bax及Caspase-3的表达水平升高,Bcl-2的表达水平降低,且Bax/Bcl-2的比值降低（均P＜0.05）。2.腺相关病毒干预酒依赖模型大鼠后行为学、病理学及分子生物学检测（1）行为学结果显示:与Con+Con-AAV组比,AD+Con-AAV组酒精干预后大鼠在旷场实验中运动总距离及中心区域探索时间减少（P＜0.05）,高架十字迷宫进入开放臂的时间降低（P＜0.05）,Y迷宫对新异臂的探索时间减少（P＜0.05）,而AD+AAVi-Tp73组在旷场实验中运动总距离及中心区域探索时间、高架十字迷宫进入开放臂的时间、Y迷宫对新异臂的探索时间都有所回升（均P＜0.05）。（2）尼氏染色结果显示:与Con+Con-AAV组相比,AD+Con-AAV组海马CA1、CA3区神经元数量减少（均P＜0.05）,胞体排列疏松,染色苍白,但DG区无明显变化;与AD+Con-AAV组相比,AAV干预后AD+AAVi-Tp73组海马CA1区、CA3区结构有所恢复,神经元数量增多（均P＜0.05）。（3）蛋白结果显示:与AD+Con-AAV组相比,AD+AAVi-Tp73组AAV干预后海马TP73蛋白表达水平显著下降（P＜0.01）,Bcl-2蛋白水平显著升高（P＜0.01）,Bax/Bcl-2比值升高（P＜0.01）,而Bax及Caspase-3的表达水平无明显变化。结论1.酒依赖大鼠存在认知功能损害,海马等脑区Tp73表达升高。2.Tp73可能通过调节海马神经元凋亡而参与酒依赖大鼠认知功能障碍的发生。第二部分miR-34b-3p对Cckbr的靶向调控研究背景研究发现miRNA是酒依赖治疗的新靶点。miR-34家族在大脑发育中的作用已经被证实,海马组织中miR-34a及miR-34c的上调与酒依赖所导致的认知功能减退相关[7],但miR-34b与酒依赖相关的研究却有限。在其它疾病的研究中发现,miR-34b-3p过表达会抑制细胞增殖、阻滞细胞周期并增加细胞凋亡,而使用miR-34b-3p的抑制剂则会提高细胞的存活率。此外,酒精的过度使用会造成中枢神经系统发育过程中细胞的凋亡。因此,本研究推测miR-34b的异常表达与酒精导致的中枢神经系统细胞的凋亡相关。目的本研究旨在探讨海马miR-34b-3p在酒依赖中的作用及其机制,进一步探究miR-34b-3p对Cckbr的调控作用,验证miR-34b-3p与细胞凋亡的关系。方法1.本研究通过前期建立的酒依赖大鼠模型,利用Western Blot和Real Time PCR检测miR-34b-3p及其靶基因Cckbr在酒依赖大鼠中的表达。2.本研究在PC12细胞中转染miR-34b-3p的模拟物,观察miR-34b-3p表达升高对Cckbr的影响,通过双荧光素酶实验来确定miR-34b-3p和Cckbr之间的相互作用。3.设置miR-34b-3p mimic转染浓度梯度,利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率的改变。4.检测转染miR-34b-3p mimic后对凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达水平的影响。结果1.Western Blot和Real Time PCR检测结果显示,在酒依赖大鼠海马脑区miR-34b-3p表达增加,Cckbr表达降低（均P＜0.05）。2.PC12细胞转染miR-34b-3p mimic后,与阴性对照组（Negative Control,NC）相比,Cckbr的蛋白表达水平降低（P＜0.05）。双荧光素酶实验显示,miR-34b-3p通过靶向其3’端非翻译区的位点调控Cckbr的表达。3.随着miR-34b-3p mimic转染浓度的升高,PC12细胞的存活率下降（均P＜0.05）。4.PC12细胞转染miR-34b-3p mimic后,与NC组相比,Bax表达水平升高,B cl-2表达水平降低（均P＜0.05）。结论酒依赖大鼠海马miR-34b-3p上调,Cckbr表达降低;miR-34b-3p靶向调控Cckbr的表达;miR-34b-3p促进细胞凋亡。