miR-1297通过靶向LOXL2抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力

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目的和背景:根据2018年GLOBOCAN的数据统计,食管恶性肿瘤是世界上发病率排名第七、死亡率排名第六的恶性肿瘤类型。而由于饮食结构的特殊性,食管鳞状细胞癌是我国发病率较高、死亡率较高且不易早期诊断的消化系统恶性肿瘤。微小RNA(microRNA)是一类长约为21个核苷酸序列的单链非编码小分子RNA。miRNA在许多细胞活动中都发挥着重要的调节作用,如增殖、分化、代谢、凋亡等过程。并且miRNA也参与疾病发生、发展和转归过程,并通过调控癌基因或抑癌基因的表达来影响肿瘤的发生发展。许多研究表明,微小RNA可以作为新的生物学标志物在癌症诊断、预后和靶向治疗中发挥作用。MiR-1297在许多癌症如非小细胞肺癌、胰腺癌中发挥重要的调控作用,且有研究证实,miR-1297在食管癌患者血清中低表达,但其在食管癌中如何发挥作用及其靶基因尚未研究。本实验目的在于探究miR-1297在食管鳞癌中的调控作用及其机制,使其有望成为食管癌早期诊断、预测预后的新分子学生物学标志物或全新的肿瘤治疗靶点。方法:(1)应用实时定量 PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法检测食管鳞癌细胞(Eca109、KYSE150)和食管正常上皮细胞中miR-1297的相对表达量并用统计学分析其是否存在表达差异。(2)用 miR-1297 mimic 和 miR-1297 inhibitor 分别转染 Eca109、KYSE150 两个食管鳞癌细胞系后,进行细胞功能试验CCK8,Transwell,观察当miR-1297过表达或沉默时细胞的增殖、迁移和侵袭能力是否受到影响。(3)通过生物信息学方法预测分析miR-1297的靶基因并通过双荧光素酶实验、Western blot实验验证miR-1297与靶基因的靶向关系。(4)同时上调或敲低miR-1297与靶基因后进行CCK8、Transwell实验,检测靶基因是否可以挽救miR-1297对细胞功能的影响,进而说明miR-1297通过靶向作用于靶基因而对细胞功能进行调控。结果:(1)qRT-PCR结果显示,miR-1297在食管鳞癌细胞中的表达量低于食管正常上皮细胞。(2)CCK8、Transwell实验结果显示,当miR-1297过表达时,细胞的增殖、迁移和侵袭能力受到抑制,当miR-1297被敲低时,细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强。也就是说,miR-1297在食管恶性肿瘤中起着抑癌基因的功能作用。(3)通过生物信息学方法预测miR-1297的靶基因为LOXL2,双荧光素酶实验结果表明miR-1297与LOXL2 3’-UTR靶向结合,WB的实验结果表明,在食管鳞癌细胞中当miR-1297过表达时,LOXL2的蛋白表达量降低,当miR-1297被敲低时,LOXL2的蛋白表达量升高。这些结果显示miR-1297与LOXL2存在靶向关系。(4)CCK8,Transwell挽救实验结果显示,在食管鳞癌细胞中上调LOXL2可以挽救miR-1297的过表达对细胞增殖、侵袭能力的抑制作用。此结果表明,miR-1297通过靶向LOXL2而对细胞的增殖、侵袭能力进行调控。结论:miR-1297在食管癌细胞中低表达,并通过靶向LOXL2抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
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