Harpin蛋白是由植物病原细菌产生的富含甘氨酸，对热稳定但对蛋白酶K敏感的一类蛋白。它在非寄主植物上能够引起过敏反应，而且很可能是植物病原细菌的一个重要的致病因子。另外，harpin蛋白还能够诱导植物产生病虫抗性以及提高作物的产量与品质。　　 本研究中，作者根据GeneBank已经登录的序列设计引物，利用PCR技术分别从水稻黄单胞两个致病变种的基因组DNA扩增到它们的harpin蛋白编码基因，即：水稻白叶枯病菌（Xanthomonas.oryzae pv.oryzae）JxoⅢ的harpinXoo蛋白编码基因hrf1和水稻细条斑病菌（X.oryzae pv.oryzicola）Rs105的harpinXooc蛋白编码基因hrf2。将hrf1和hrf2克隆至pGEM-T Easy载体经测序验证无误后分别克隆至pGEX-EF载体，构建了表达融合蛋白GST-harpinx的原核表达载体pGEX-hrf1和pGEX-hrf2。研究表明，融合蛋白GST-harpinX表达菌株BL21/pGEX-hrf1和BL21/pGEX-hrf2在0.1 mM IPTG、28℃诱导4 h的条件下都能够很好地表达融合蛋白GST-harpinX，且主要以可溶形式存在。没有诱导剂IPTG存在的情况下，融合蛋白GST-harpinX不表达，表明融合蛋白GST-harpinX是诱导表达的，而继续提高诱导剂IPTG的浓度和延长诱导时间对融合蛋白GST-harpinx的表达量影响不大。37℃诱导时，融合蛋白GST-harpinXooc表达产物仍主要以可溶形式存在，与28℃诱导时比较没有明显变化，而融合蛋白GST-harpinXoo的表达产物则主要以不溶的包涵体形式存在于细胞超声破碎后的沉淀中。　　 利用Bulk GST Purification Module和Thrombin Cleavage Capture Kit两个试剂盒对harpinX进行了纯化。每升诱导培养细胞可收获纯化harpinX蛋白≥6 mg，纯化蛋白的浓度达到了1.5～2.0 mg/ml。GST-harpinX融合蛋白和harpinX纯化蛋白均能够在非寄主植物烟草上引起过敏反应。由于在纯harpinX时作者采用了沸水浴的步骤，因此纯化的harpinX蛋白具有很好的热稳定性；但GST-harpinX融合蛋白沸水浴处理后，再进行SDS-PAEG分析时，已找不到相应条带，说明harpinX与GST的融合破坏了它的热稳定性。　　 用纯化蛋白harpinX免疫新西兰大白兔制备了抗血清，抗harpinXoo血清的效价可达1:3000以上，而抗harpinXooc血清的效价可达1:6000以上。采用蛋白A柱层析法纯化抗体，两种纯化IgG的蛋白浓度分别为1.3 mg/ml（抗harpinXoo）和0.6 mg/ml（抗harpinXooc）。　　 在酶联免疫、Dot blot、Western blot分析中，两种harpinX的多克隆抗体均能够检测含有harpinX蛋白的不同样品。两抗体之间存在一定程度的交叉反应，即：harpinXoo蛋白的多克隆抗体能够识别蛋白harpinXooc，harpinXooc蛋白的多克隆抗体也能够识别蛋白harpinXoo。由于hrf1和hrf2基因的推测产物氨基酸序列一致性达67.4％，因此它们之间存在交叉反应是不意外的。　　 构建了一批植物转基因双元载体，包括含有nptⅡ卡那霉素标记基因的hrf1基因单价载体pBⅠ-hrf1-nptⅡ；含有bar除草剂标记基因的hrf1基因单价载体pCAMBIA-hrf1-bar，hrf2基因单价载体pCAMBIA-hrf2-bar，hrf1和hrf2基因双价载体pCAMBIA-hrf1-hrf2-bar，根据棉花遗传密码子优化的hrf2基因单价载体pCAMBIA-Mhrf2-bar；没有标记基因的hrf2基因单价载体pCAMBIA-hrf2。　　 利用花粉管通道技术将上述转基因双元载体对棉花进行了转化。收获的种子种植于黄萎病病圃。棉花长至3～4片真叶时，进行卡那霉素和除草剂涂抹筛选，共进行3次，绝大部分棉苗都因叶片变色而被剔除，只有极少数不到1％（0.57～0.98％）的棉苗表现出卡那霉素或除草剂抗性；而有关海岛棉新海21的转基因组合可能是由于获得的种子太少的原因，没有筛选到抗性苗。　　 经过苗期的卡那霉素或除草剂筛选后，对筛选得到的卡那霉素或除草剂抗性植株及非转基因对照植株和感病对照植株的黄萎病情进行了统计。卡那霉素或除草剂抗性植株的黄萎病发病率明显低于非转基因对照植株，由80％左右（83.3％和77.3％）降至50％多（57.1％、58.7％和55.30％），病情指数也由30多降至20多。抗性植株中表达harpinX蛋白转基因植株的存在很可能就是发病率和病情指数降低的原因。　　 选择部分抗病性较好的卡那霉素或除草剂抗性植株进行了PCR检测。hrf1或hrf2全长基因扩增阳性的株系，用其内部引物扩增仍为阳性，但用vector引物、35S引物、NOS引物依次检测上述阳性株系时发现仅有部分植株为阳性，这说明整合进入棉花基因组的外源片段情况比较复杂，有些可能只是hrfX基因已经整合进棉花基因组，而表达调控元件如启动子或终止子并没有进入棉花基因组。最后nptⅡ引物或bar引物检测表明，上述检测阳性的卡那霉素或除草剂抗性植株都能扩出阳性条带。　　 提取PCR检测均为阳性的植株的可溶性蛋白，进行了Western blot和生物活性分析。结果显示，并不是所有的PCR阳性植株而只是部分植株可检测到harpinX蛋白的表达。这说明基因及其表达调控元件即使都整合进入受体基因组，也不能确保基因的表达。　　 黄萎病抗性表现较好以及分子检测和生物活性分析均为阳性的单株后代，黄萎病抗性表现较好没有进行分子验证和生物活性分析的混合后代，再次进行了黄萎病抗性分析。其中某些单株后代（A-1，A-3和B-1）和混合后代（A-X）已达到耐病水平，而单株后代H-1达到抗病水平。　　 有关棉花单铃籽棉均重、衣分和纤维平均长度的数据显示，转基因品系保持了出发品种的品质，没有发生明显变化。　　 农杆菌转化棉花茎尖组织后，在筛选培养基MSb上培养两周得到了一定数量的抗性苗，但切取抗性苗心芽再次在MSb培养基上筛选，没有得到抗性苗。说明该实验中所得抗性苗均为嵌合体，而且新生部分为非转化细胞。因此，作者认为现有的茎尖转化技术不能很好地应用于棉花转基因研究，尚需进一步改进。　　 下胚轴是农杆菌转化棉花研究中最常用的外植体。本研究中发现，暗培养的无菌苗下胚轴非常脆，进行愈伤组织诱导时，愈伤组织的产生频率很低，而由光/暗交替处理的无菌苗所得到的外植体产生愈伤组织较快，质量好，产生频率也较高。　　 总之，作者构建了水稻黄单胞harpinX蛋白的融合表达载体，纯化了harpinX蛋白，制备了harpinx的多克隆抗体，并对两种harpinX多克隆抗体的相互检测进行了研究；同时，利用花粉管通道技术将harpinX蛋白编码基因hrfX转入棉花，经过分子验证和表达蛋白生物活性检测的转基因棉花表现出一定的黄萎病抗性，某些单株后代仍保持一定的抗性，且转基因品系保持了出发品种的品质；农杆菌转hrfX基因棉花初步研究表明，农杆菌转化茎尖组织技术不能完全适用于转基因棉花研究，而在农杆菌转化棉花下胚轴技术中无菌苗的准备是十分关键的。