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目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对脾脏T细胞的免疫调节作用及杀伤能力的影响,并探讨其对移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)模型大鼠的免疫调节活性及其作用机制,为MSCs在异基因骨髓移植中的应用提供科学依据。方法:1利用全骨髓细胞贴壁培养法培养MSCs,倒置相差显微镜下观察细胞形态,并对第三代MSCs行瑞氏-姬姆萨染色,在倒置荧光显微镜下观察染色后的细胞形态。用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测第三代MSCs表面标志性分子的表达。通过诱导MSCs向成脂肪、成骨方向分化,来研究MSCs的多向分化能力。2采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法研究不同比例MSCs(MSCs: T细胞分别为1:20、1:10、1: 5)对刀豆蛋白A(ConA)刺激T细胞增殖反应的抑制作用。应用FCM检测在20μg/ml ConA刺激下,单独培养或与不同比例的MSCs(MSCs:T细胞分别为1:20、1:10、1:5)共培养24h后,T细胞表面CD25的表达情况。3在20μg/ml ConA刺激下,T细胞单独培养或与不同比例的MSCs(MSCs:T细胞分别为1:20、1:10、1:5)共培养72h后,采用ELISA法检测培养上清中IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-10的表达水平;用FCM检测T细胞的凋亡水平。采用MTT法检测在10μg/ml ConA刺激下,MNC单独培养或与MSCs(MSCs:MNC为1:5)共培养96h后,由脾MNC诱导的CTL对L1210细胞的杀伤能力。4从SD大鼠骨髓中分离培养MSCs。通过给放射线照射过的Wistar大鼠进行干细胞和单个核细胞(mononuclearcell,MNC)共同移植,建立大鼠GVHD模型,对其进行异基因骨髓移植的同时,共输注不同数量的供者源性的MSCs(MSCs:MNC细胞分别为1:10、1:5、1:1),观察受鼠的一般表现、生存期及病理损伤的变化。5应用ELISA法检测各实验组受鼠外周血血清中细胞因子IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-10的变化;利用逆转录-聚合酶链式反应(revers transcription PCR,RT-PCR)技术从基因角度检测了受鼠外周血MNC中IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-10mRNA的表达水平。6用FCM检测各组受鼠外周血MNC中CD4~+CD25~+调节性T细胞的比例变化。用免疫细胞化学法检测各实验组受鼠外周血MNC中Foxp3~+细胞比例的变化。诱导各组受鼠脾脏MNC为细胞毒性T细胞(cytotoxic T cells,CTL),用MTT法检测各组受鼠CTL对L1210细胞的杀伤活性。结果:1原代MSCs在体外培养72h即可见形态不均一的散在贴壁细胞,呈成纤维样形态,10天左右时,细胞集落达到90%融合。传代后的细胞,在7天左右可至90%融合生长,提示骨髓MSCs在体外有较强的增殖能力。FCM结果显示,第三代MSCs表达CD44和CD29,但不表达CD34和CD45。体外应用相应的诱导体系,可使大鼠MSCs向成骨、成脂肪方向分化。2 MSCs能够显著抑制ConA刺激的T细胞增殖反应,与MSCs共培养的T细胞,其刺激指数明显低于T细胞单独培养组,而且这种抑制作用随MSCs比例的增加而增强(P<0.01)。FCM结果显示,MSCs能够显著抑制活化T细胞表达CD25,在20μg/ml ConA刺激下,与MSCs共培养24h后的T细胞表达CD25的水平明显低于T细胞单独培养组(P<0.01),且这种抑制作用随MSCs比例的增加而增强。3 ELISA实验结果显示,在20μg/ml ConA刺激下,将T细胞与MSCs共培养,培养上清中IFN-γ和TNF-α水平明显低于T细胞单独培养组,但IL-4和IL-10的水平明显高于单独培养组,且这种作用随MSCs比例的增加而增强(P<0.01)。FCM结果显示,20μg/ml ConA刺激72h后,与不同比例MSCs共培养的T细胞,其早期凋亡细胞(AnnexinV~+PI- T cells)的比例均明显低于T细胞单独培养组(P<0.01);而当MSCs与T细胞以1:20共培养时,T细胞中发生晚期凋亡细胞(AnnexinV~+PI~+ T cells)的比例与T细胞单独培养组相比,没有明显差异(P>0.05),当MSCs与T细胞以1:10、1:5共培养时,T细胞中发生晚期凋亡细胞(AnnexinV~+PI~+ T cells)的比例明显低于T细胞单独培养组(P<0.01)。与MSCs共培养后,CTL对L1210细胞的杀伤活性和CTL单独培养组相比明显下降(P<0.05)。4异基因骨髓移植时,共输注供鼠MSCs能够明显降低GVHD的发生率,并减轻其病理损伤,延长生存时间(P<0.05)。5 ELISA结果显示,共输注MSCs后,受鼠血清中IFN-γ、TNF-α水平明显减低而IL-4、IL-10水平明显增加,并且MSCs的数量越多,差异越明显(P<0.05)。同样,IFN-γ、TNF-αmRNA表达水平明显减低,IL-4、IL-10mRNA表达水平明显增加(P<0.05)。6 FCM结果显示,与GVHD组大鼠相比,共输注MSCs的各组大鼠外周血中CD4~+CD25~+调节性T细胞的比例明显增加,且这种作用随MSCs比例的增加而增强(P<0.05)。与GVHD组大鼠相比,共输注MSCs的各组大鼠外周血中Foxp3~+细胞比例明显增加(P<0.05),而CTL杀伤活性明显减弱。结论:1利用全骨髓细胞贴壁培养法可以从SD大鼠骨髓中扩增出一定数量、纯度较高的MSCs,其生物学特性与干细胞相符。2 MSCs能够明显抑制T细胞的增殖反应,并能够抑制其表达活化标志CD25,这种抑制作用与MSCs具有明显的量效依赖关系。3 MSCs对T细胞免疫调节作用的机制可能与MSCs抑制T细胞表达TNF-α和IFN-γ,促进T细胞表达免疫抑制性细胞因子IL-4和IL-10有关。但该机制与诱导T细胞凋亡无明显相关。4体内移植供者MSCs可降低异体骨髓移植中受鼠GVHD的严重程度和发生率,延长受鼠的生存时间。该机制可能与MSCs能够下调外周血中TNF-α和IFN-γ的含量,上调IL-4和IL-10的含量有关。并与Treg细胞比例的上调有关。5共输注MSCs的各组大鼠,由脾脏MNC诱导的CTL杀伤肿瘤细胞的作用明显低于GVHD组。