胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）属于四级胶质瘤,被认为是最恶性和最具侵袭性的人类脑肿瘤,也是成年人最常见的脑肿瘤。胶质母细胞瘤患者的预后极差,一般确诊后的中位生存期仅为14个月。在世界范围内,GBM每年造成约20万多人死亡,男性的发病率高于女性。目前最有效的治疗方法是外科手术、放疗以及化疗等医学手段。但是由于该实体瘤位于脑部,因此外科手术不仅难度极大同时医疗费用也是极高。同时,血脑屏障的存在也使得能治疗GBM的有效化疗药物相对较少。因此迫切需要筛选鉴定出有效的生物标记物,阐明胶质母细胞瘤的发病机理,探索出胶质母细胞瘤合适的治疗靶标。组蛋白去甲基化酶KDM4家族一般定位于核内,能通过Jmj C结构域将组蛋白尾部赖氨酸残基中的甲基基团去除,从而调节基因的转录活性。目前,在人类基因组上已鉴定出6种KDM4家族的蛋白质,包括KDM4A,KDM4B,KDM4C,KDM4D,KDM4E,KDM4F。其中KDM4A-C含有Jmj N、Jmj C、两个PHD结构域和两个TUDOR结构域,而KDM4D-F仅含有Jmj N和Jmj C两个功能性结构域。Jmj C结构域是行使组蛋白去甲基化功能的主要区域,基本蛋白质结构是一个β片“果冻卷”,其中心活性位点中配位有二价铁离子（Fe2+）活性中心位点。它将α-酮戊二酸和O2作为底物辅助因子,在组蛋白末端赖氨酸上通过羟基化反应去除三甲基化或二甲基化状态。各种研究表明,KDM4A、KDM4B和KDM4C在乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、前列腺癌和其他肿瘤中过表达,是癌细胞高效生长所必需的,这可能是由于它们能够开启染色质的能力相关。KDM4B主要去甲基化H3K9me3/me2,开放染色质,促进分化,性激素和DNA损伤修复等基因的转录表达。近年来,KDM4B被发现在乳腺癌,前列腺癌,胃癌和神经母细胞瘤等肿瘤中高表达,且发挥了关键性的调控作用。KDM4B作为组蛋白去甲基化酶,不仅仅参与癌基因的转录,还与癌蛋白质共同作用,开启下游基因的表达。例如在乳腺癌中,KDM4B不仅转录调控雌激素受体（ER）,还与ER相互结合,协助转录下游MYC,MYB和CCND1等基因,促进癌细胞的增殖。研究发现,前列腺癌的去势抵抗性也与KDM4B相关。多篇报道指出KDM4B参与DNA修复,已经成为放射疗法的阻碍。在脑胶质母细胞瘤中,KDM4B的功能和机制尚未有过报道,然而我们通过大数据分析发现它与多个临床不良预后呈正相关。因此探究KDM4B在胶质母细胞瘤中的重要意义和功能,为设计GBM的基因靶向治疗药物提供重要的理论基础。转录因子c-MYC可与人类基因组中15%的启动子结合,主要起促进增殖的作用。在正常细胞中,c-MYC的表达和活性受到严格控制。在大多数人类肿瘤类型中,c-MYC与多种致癌途径相关,其异常高表达往往与不良预后相关。在本研究中,我们发现在胶质母细胞瘤中KDM4B不仅能稳定c-MYC表达还能参与c-MYC信号通路。主要实验结果如下:1.KDM4B的表达与胶质母细胞瘤患者的预后关系为了确定KDM4B在胶质母细胞瘤中的扮演的角色,我们通过癌症基因组图谱（TCGA）发现KDM4B在胶质母细胞瘤组织中的表达较高,并随着胶质瘤级别的升高而升高。并且,KDM4B的基因表达水平与多个胶质母细胞瘤临床不良预后正相关。当KDM4B在胶质母细胞瘤中高表达时,患者的生存率也降低。综上所述,我们推测KDM4B在胶质母细胞瘤中高表达并且与患者的不良预后可能相关,因此我们选定KDM4B表达量较高的U87-MG和LN229进行相关的实验探究。2.KDM4B调控胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移侵袭以及肿瘤生成为了探索KDM4B在胶质母细胞瘤增殖方面的影响,我们通过慢病毒介导的RNAi技术在U87-MG和LN229细胞中RNA干扰KDM4B的表达,通过MTT和平板克隆形成实验检测到细胞增殖明显减慢。通过流式细胞仪检测了在RNA干扰KDM4B后细胞的周期进程,发现RNA干扰KDM4B后细胞阻滞在G2/M期。并在RNA干扰后检测了相关周期蛋白质的表达情况,结果发现c-MYC下游通路中的G2/M期相关蛋白质cyclin B1和CDK1显著下调。我们通过皮下成瘤实验和软琼脂克隆形成分析实验发现RNA干扰KDM4B后显著抑制了胶质母细胞瘤细胞的体内外成瘤能力。之后我们通过细胞迁移能力或侵袭能力分析实验和划痕愈合实验发现RNA干扰KDM4B后抑制了胶质母细胞瘤的迁移侵袭,免疫印迹实验显示Snail、Slug和MMP2表达下调,E-cadherin的表达上调。3.KDM4B对c-MYC信号通路的调控c-MYC是经典的癌基因,在多种癌症中主要通过调控细胞周期和细胞增殖促进癌症进程,并且高表达的c-MYC往往表示着较差的预后。在我们的研究中,KDM4B被发现与c-MYC以及c-MYC信号通路呈正相关。之后通过泛素化实验以及添加蛋白质酶体抑制剂MG132和蛋白质合成抑制剂放线菌酮（CHX）,验证了KDM4B主要通过泛素化调控c-MYC的稳定性。同时,我们通过q RT-PCR实验和免疫印迹实验结果发现KDM4B可能通过调控泛素连接酶复合物FBXL3/CRY2的表达来稳定c-MYC蛋白质。在前人的研究中,我们关注到了miR-181d-5p这个micro RNA,它在结直肠癌中能靶向FBXL3和CRY2的m RNA,来稳定c-MYC的表达。并且在胶质母细胞瘤中,miR-181d-5p也被认为是肿瘤恶化的标记物。我们的研究发现KDM4B与miR-181d-5p的表达正相关,同时其表达与KDM4B的Jmj C功能结构域的存在呈正相关。因此,我们证明KDM4B通过组蛋白去甲基化反应上调miR-181d-5p,从而抑制FBXL3和CRY2的表达来稳定cMYC蛋白质。之后,通过MTT实验和平板克隆形成实验,我们发现RNA干扰KDM4B后再过表达miR-181d-5p仅仅上调c-MYC的蛋白质表达但无法恢复cMYC下游信号通路,同时也无法逆转增殖抑制的趋势。通过IP实验和Ch IP实验,我们发现KDM4B不仅能够与c-MYC共同作用,还能结合在CCNB1的启动子区域的染色质上,这说明KDM4B与c-MYC共同促进c-MYC下游信号通路。以上实验结果说明KDM4B通过miR-181d-5p/FBXL3/CRY2抑制c-MYC的泛素化水平,同时通过组蛋白去甲基化酶反应参与c-MYC的调控通路,KDM4B是胶质母细胞瘤发展进程的关键基因。