第一部分hcdc14A在不同条件下人平滑肌等细胞中的表达变化目的:观察hcdc14A在人平滑肌等细胞中不同干预条件下的表达变化。方法:利用XTT法和细胞动态分析仪观察细胞在葡萄糖刺激下增殖能力的变化。分别用不同条件的高葡萄糖和胰岛素干预人平滑肌细胞。此外,还应用葡萄糖,LDL以及FFA干预人巨噬细胞。提取细胞蛋白后,应用western blot法检测细胞中hcdc14A的蛋白表达水平。结果:平滑肌细胞在葡萄糖刺激下增殖能力增加。葡萄糖和胰岛素干预平滑肌细胞后,hcdc14A蛋白的表达水平有所增加。不同条件干预人巨噬细胞后,hcdc14A的蛋白表达水平也有上升趋势。结论:在糖、胰岛素等条件干预下,细胞增殖能力增强,并且hcdc14A表达量有所增加,这一现象提示hcdc14A的高表达可能通过对抗Cdk/cyclin活性的增强,促进了细胞有丝分裂的退出,从而加速细胞周期进程,使细胞进入又一轮新的有丝分裂周期,或者影响细胞内信号通路的传递,最终导致细胞的增殖增加。此外,hcdc14A的高表达还可能导致细胞正常生理功能的异常,在糖尿病血管平滑肌细胞病变中可能发挥了一定作用。第二部分hcdc14A与细胞周期蛋白在平滑肌细胞中的相互作用目的:观察bcdc14A与细胞周期蛋白在平滑肌细胞中的相互作用。方法:高葡萄糖、高胰岛素干预平滑肌细胞后,提取细胞蛋白,应用western blot法检测细胞周期蛋白cyclinB和P53的表达。构建hcdc14A的真核表达载体,转染细胞后观察其定位,并检测过表达hcdc14A后,cyclinB和P53的表达量是否有相应的变化。结果:高葡萄糖和胰岛素干预平滑肌细胞后,细胞周期蛋白cyclinB和P53的表达水平均有所增加。hcdc14A的真核表达载体构建成功,其定位在细胞中心体上。过表达hcdc14A可使P53表达量增多,而cyclinB则无明显变化。结论:Hcdc14A和cyclinB在高糖、高胰岛素刺激下,可能存在相互协同的作用,分别促进细胞有丝分裂的退出和进入,对平滑肌细胞正常的有丝分裂进程有所影响。而hcdc14A一方面可使p53去磷酸化,对抗cyclin/Cdk的活性,另一方面环境刺激和hcdc14A的表达量改变也可能使细胞内突变型P53增加,影响野生型P53的作用,从而促凋亡的能力减弱。因此,细胞周期蛋白和hcdc14A在血管平滑肌细胞的病变中可能协同发挥了一定的作用。第三部分hcdc14A相互作用蛋白的验证目的:验证通过酵母双杂交筛选出的与hcdc14A相互作用的蛋白Zipk。方法:构建各种真核与大肠杆菌表达质粒后,利用体外Pulldown试验和免疫共沉淀试验验证hede14A和Zipk间的相互作用。并且两种质粒共转细胞后,观察其共定位情况。结果:体外Pulldown试验和免疫共沉淀试验结果提示两者确实可以相互作用,并且发现Zipk可以与hcdc14A的N端(磷酸酶活性端)相互结合。hcdc14A和Zipk的表达质粒共同转入Hela细胞后,我们观察到两者有共同的细胞内定位。结论:研究结果已经证实hcdc14A和Zipk有相互作用,为寻找调控hcdc14A的蛋白打下一定的基础。而已知的Zipk蛋白的功能,可能对hcdc14A有所调控。Zipk蛋白对hcdc14A的调控作用,以及自身促进平滑肌收缩的功能可能在血管平滑肌病变中也起了一定的作用。第四部分Zipk在平滑肌中的表达及其对hcdc14A的调控目的:观察糖、胰岛素刺激后,Zipk在平滑肌中的表达,并进一步研究Zipk与hcdc14A的相互作用。方法:构建各种质粒后,分别共转细胞以观察两者定位的变化,初步判断蛋白的相互作用。高葡萄糖、高胰岛素干预平滑肌细胞后,提取细胞蛋白,利用western blot法检测细胞Zipk的表达变化。过表达Zipk后,检测hcdc14A的表达量是否有相应的变化。结果:共转Zipk和hcdc14A—N端(磷酸酶活性端)质粒后,Zipk改变了hcdc14A—N端在细胞内的定位,使其从细胞核上释放到了细胞浆内。而Zipk—KD(激酶失活质粒)并不能影响hcdc14A—N端的定位。葡萄糖干预平滑肌细胞后,Zipk表达量增加。而胰岛素干预之后,其表达量则有所减少。过表达Zipk可使hcdc14A的表达增加。结论:Zipk和hcdc14A的共定位可能依赖于Zipk的激酶活性,Zipk使hcdc14A的N端从细胞核释放到细胞浆内,我们猜测Zipk可能通过这一过程促使hcdc14A发挥磷酸酶活性。Zipk除了影响hcdc14A的活性,还可以影响其表达水平。高糖刺激下,诱导了平滑肌细胞中Zipk的高表达,而高表达的Zipk可能通过对hcdc14A活性和表达量的调控以及自身促平滑肌收缩的功能在糖尿病血管平滑肌细胞病变中起了一定的作用。而胰岛素干预下,平滑肌细胞中Zipk减少,可能是胰岛素发挥保护作用的又一机制。