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目的:间充质干细胞是近年来治疗软骨缺损的潜力巨大的种子细胞,其可来源于多种组织,大多数研究为获得足够多的细胞数量,治疗前均先将干细胞进行体外扩增,然而体外扩增会引起干细胞的衰老并影响其分化能力,既往研究显示骨髓间充质干细胞体外扩增至第三代后其成软骨能力和软骨修复治疗效果较原代骨髓间充质干细胞均有下降,但其中的具体调控机制尚不明。本研究旨在通过转录组测序比较骨髓间充质干细胞体外扩增与否产生的差异基因和不同通路,查找出影响软骨分化能力的关键基因和通路,并通过实验进一步验证其结果。方法:先进行骨髓间充质干细胞的提取,6只2.5～3kg大小2月龄新西兰大白兔,麻醉后用16G骨穿针在双侧股骨髁、胫骨上段进行穿刺,每只穿刺抽取约20ml骨髓,使用兔骨髓干细胞分离试剂盒提取骨髓间充质干细胞,将干细胞分成2组:P0组:新鲜提取的兔原代骨髓间充质干细胞,未经扩增和冻存;P3组:使用扩增传代至第三代的兔骨髓间充质干细胞,未经冻存。提取P0组和P3组细胞RNA,进行转录组测序。测序完成后通过生物信息学技术,筛选出差异基因,进行KEGG通路分析查找出相关通路,结合文献报道选择内质网应激的未折叠蛋白反应通路作为关键通路,用qRT-PCR验证相关基因表达差异。根据结果进行下一步实验:取60只新西兰大白兔提取骨髓间充质干细胞,方法同前,将干细胞分成4组:P0组;P0+4-PBA组:首先每日通过灌胃方式给予兔0.25 g/kg剂量的内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate,4-PBA),连续喂服20天之后,提取兔原代骨髓间充质干细胞用于后续实验;P3组;P3+TM组:使用传至第三代的兔骨髓间充质干细胞,孵育0.25 μg/ml的内质网应激激动剂衣霉素(tunicamycin,TM)48小时后用于后续实验。将以上4组干细胞转移至15ml离心管中,计数调整细胞量一致后离心后去除上清液,每管滴入胶原水凝胶并充分混匀,成胶后加入软骨诱导液,培养7天,14天,21天。每个时间点提取样品,进行如下检测:(1)用qRT-PCR技术检测软骨形成过程中软骨相关基因(ACAN,SOX9,COL2A1,COL1A1)和内质网应激相关基因(ATF4,ATF6,XBP1)的表达情况;(2)通过免疫印迹Western blot和免疫荧光染色检测内质网应激相关蛋白(ATF4,ATF6,XBP1)和软骨形成特异性蛋白COL2A1的表达情况;(3)采用MTT实验和DNA含量检测各组之间的细胞增殖情况;(4)番红O染色和DMMB检测细胞分泌软骨特异基质糖胺聚糖的含量。通过以上实验手段,检测各组骨髓间充质干细胞在体外成软骨能力和内质网应激水平的差异。为进一步研究内质网应激对骨髓间充质干细胞软骨缺损修复能力的影响,本研究进行了兔软骨缺损修复的体内实验。先将90只新西兰大白兔进行全身麻醉,手术切开双侧膝关节暴露股骨滑车,在其中部造成4mm软骨层缺损模型,然后将胶原水凝胶混合不同组骨髓间充质干细胞填补于缺损软骨处。根据不同的干细胞将兔子分成4组:P0组:软骨缺损部位植入的细胞为原代干细胞;P0+4-PBA组:该组兔子之前先连续20天服用剂量为0.25 g/kg的4-PBA,提取骨髓原代干细胞混合胶原水凝胶进行软骨缺损修补;P3组:软骨缺损部位植入的细胞为第三代干细胞;P3+TM组:软骨缺损部位植入的细胞为经衣霉素孵育48小时后的第三代干细胞。在手术后第4、12、26周取材,进行如下检测:(1)大体评分:对关节的软骨修复部位进行大体评分,大体检测软骨缺损修复情况;(2)生物力学检测:通过检测修复区新生软骨的力学性能反映修复效果;(3)番红-固绿染色及评分:检测修复部位的干细胞成软骨分化情况和软骨特异基质糖胺聚糖的分泌情况等评价修复效果;(4)使用免疫组织化学检测新生软骨组织Ⅱ型胶原的分泌情况。通过以上检测手段,反映体外扩增与否的、不同内质网应激水平的自体骨髓间充质干细胞对兔软骨缺损修复的效果差异。结果:转录组测序结果分析显示,扩增至第三代的干细胞P3相比原代干细胞P0,共4324个差异基因,其中1143个为上调基因,3181个为下调基因。将差异基因进行KEGG通路分析,发现差异基因富集于以下通路中:粘着斑通路、PI3K-Akt通路、细胞周期通路、肌动蛋白细胞骨架的调节通路、MAPK通路、内质网应激通路、toll样受体通路,缺氧诱导因子-1通路等。其中内质网应激相关基因,在P3组中大部分都比P0组降低。结合文献报道结果,我们将内质网应激的未折叠蛋白反应通路作为本课题研究的目的通路。随后,我们用qRT-PCR验证测序结果,发现ATF4、XBP1、和ATF6三个未折叠蛋白反应关键基因在P3组中表达均低于P0组,这与测序结果相一致。使用qRT-PCR、Western blot和免疫荧光染色检测各组未折叠蛋白反应相关基因和蛋白可知,PO组的未折叠蛋白反应相关基因和蛋白(ATF4,ATF6,XBP1)的表达水平高于P3组,P0+4-PBA组表达水平显著低于P0组,说明4-PBA能明显抑制兔原代骨髓间充质干细胞的内质网应激水平,P3+TM组内质网应激相关基因和蛋白在各时间点表达水平明显高于P3组(P<0.05),说明TM能明显提升兔第三代骨髓间充质干细胞的内质网应激水平。通过qRT-PCR、Western blot、免疫荧光染色、GAG/DNA和番红O染色检测成软骨相关结果可知,各组干细胞成软骨诱导成功。P0组在各时间点成软骨水平高于P3组,P0+4-PBA成软骨能力低于P0组,P3+TM成软骨能力强于P3组。说明抑制原代骨髓间充质干细胞的内质网应激水平会损害其软骨分化能力,而提高第三代骨髓间充质干细胞的内质网应激水平能促进其软骨分化能力。构建兔体内软骨缺损模型,通过大体评分、修复软骨生物力学检测、番红-固绿染色及组织学评分和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色可知,在4周、12周、26周,P0组评分均高于P3组,提示原代间充质干细胞的软骨修复能力强于第三代间充质干细胞,同时在各个时间点,P0+4-PBA组的软骨修复效果差于P0组,而P3+TM组的修复效果则好于P3组,说明初始的干细胞内质网应激水平对软骨再生有较强的影响,抑制原代骨髓间充质干细胞的内质网应激水平影响软骨修复,而提高第三代干细胞的内质网应激水平促进软骨修复。结论:骨髓间充质干细胞体外培养扩增通过影响内质网应激水平导致成软骨能力下降,增强第三代骨髓间充质干细胞的内质网应激能促进成软骨分化和软骨缺损的修复,抑制原代骨髓间充质干细胞的内质网应激会减弱成软骨分化和软骨缺损的修复效果。