Racl GTP酶的活化对白血病细胞在骨髓微环境中的滞留及其在干性维持中的作用

来源 :北京协和医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:Q529801428
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目的:研究Rac1GTP酶的活化对白血病细胞抵抗药物杀伤、周期、和归巢等干性特征的影响。方法:用构建的Rac1组成活化型慢病毒载体pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-Rac1-V12、Rac1负显性抑制型慢病毒载体pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-Rac1-N17以及慢病毒空载体pCDH-MCS1-EF1-copGFP分别转染KGla细胞;流式细胞仪技术检测VP16对三种KGla处理24h和48h后的细胞凋亡情况;流式细胞仪技术检测三种KGla细胞的GO期细胞比例的差异;流式细胞仪技术检测用Rac1特异性抑制剂NSC23766对KG1a细胞处理4天后,细胞GO期比例的变化;将三种KGla细胞分别尾静脉注射到亚致死剂量照射过的NOD/SCID小鼠体内,16h后用流式细胞仪技术检测骨髓中三种细胞的归巢能力;对小鼠的骨髓切片进行免疫组化染色,以观察白血病细胞在骨髓中的定位情况;实时定量PCR技术检测GO期相关基因的mRNA在三种KG1a细胞中的表达差异;免疫荧光共聚焦技术观察相关分子在细胞中的表达;将三种KGla细胞分别与成骨细胞共培养,检测细胞GO期比例。结果:在VP16处理细胞24h和48h后,感染Rac1负显性抑制型慢病毒载体的KGla细胞(Rac1-N17-KG1a)早期凋亡和晚期凋亡的比例显著高于感染Rac1组成活化型慢病毒载体的KGla细胞(Rac1-V12-KG1a)(P<0.05); Rac1-V12-KG1a细胞的GO期细胞比例最高,而Rac1-N17-KG1a细胞的GO期比例最低,三者的GO期比例相比具有显著性差异(P<0.05); Rac1特异性抑制剂处理的KGla细胞随着抑制剂浓度的增加,GO细胞比例显著下降(P<0.05); Rac1-V12-KG1a细胞的归巢能力要显著高于Rac1-N17-KG1a细胞(P<0.05);通过免疫组化染色观察到KGla细胞主要定位在成骨细胞区;通过实时定量PCR检测发现,N-Cadherin、Tie-2和c-MPL三种基因的mRNA表达水平在Rac1-V12-KG1a细胞中显著高于Rac1-N17-KG1a细胞(P<0.05),免疫荧光共聚焦显微镜观察确定三种分子的蛋白表达与mRNA表达趋势一致;与成骨细胞共培养后GO期细胞比例趋势与未共培养的相一致,三组细胞GO期细胞比例均有明显上升(P<0.05)。结论:Rac1GTP酶的活化能够通过上调N-Cadherin、Tie-2和c-MPL三种基因的表达,提高白血病细胞在骨髓中的归巢能力,增加休眠期细胞的比例,导致白血病细胞对化疗药物的抗药性增强;也能够直接提高白血病细胞的休眠期细胞比例,增强白血病细胞对化疗药物的抗药性。
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