论文部分内容阅读
目的:研究Rac1GTP酶的活化对白血病细胞抵抗药物杀伤、周期、和归巢等干性特征的影响。方法:用构建的Rac1组成活化型慢病毒载体pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-Rac1-V12、Rac1负显性抑制型慢病毒载体pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-Rac1-N17以及慢病毒空载体pCDH-MCS1-EF1-copGFP分别转染KGla细胞;流式细胞仪技术检测VP16对三种KGla处理24h和48h后的细胞凋亡情况;流式细胞仪技术检测三种KGla细胞的GO期细胞比例的差异;流式细胞仪技术检测用Rac1特异性抑制剂NSC23766对KG1a细胞处理4天后,细胞GO期比例的变化;将三种KGla细胞分别尾静脉注射到亚致死剂量照射过的NOD/SCID小鼠体内,16h后用流式细胞仪技术检测骨髓中三种细胞的归巢能力;对小鼠的骨髓切片进行免疫组化染色,以观察白血病细胞在骨髓中的定位情况;实时定量PCR技术检测GO期相关基因的mRNA在三种KG1a细胞中的表达差异;免疫荧光共聚焦技术观察相关分子在细胞中的表达;将三种KGla细胞分别与成骨细胞共培养,检测细胞GO期比例。结果:在VP16处理细胞24h和48h后,感染Rac1负显性抑制型慢病毒载体的KGla细胞(Rac1-N17-KG1a)早期凋亡和晚期凋亡的比例显著高于感染Rac1组成活化型慢病毒载体的KGla细胞(Rac1-V12-KG1a)(P<0.05); Rac1-V12-KG1a细胞的GO期细胞比例最高,而Rac1-N17-KG1a细胞的GO期比例最低,三者的GO期比例相比具有显著性差异(P<0.05); Rac1特异性抑制剂处理的KGla细胞随着抑制剂浓度的增加,GO细胞比例显著下降(P<0.05); Rac1-V12-KG1a细胞的归巢能力要显著高于Rac1-N17-KG1a细胞(P<0.05);通过免疫组化染色观察到KGla细胞主要定位在成骨细胞区;通过实时定量PCR检测发现,N-Cadherin、Tie-2和c-MPL三种基因的mRNA表达水平在Rac1-V12-KG1a细胞中显著高于Rac1-N17-KG1a细胞(P<0.05),免疫荧光共聚焦显微镜观察确定三种分子的蛋白表达与mRNA表达趋势一致;与成骨细胞共培养后GO期细胞比例趋势与未共培养的相一致,三组细胞GO期细胞比例均有明显上升(P<0.05)。结论:Rac1GTP酶的活化能够通过上调N-Cadherin、Tie-2和c-MPL三种基因的表达,提高白血病细胞在骨髓中的归巢能力,增加休眠期细胞的比例,导致白血病细胞对化疗药物的抗药性增强;也能够直接提高白血病细胞的休眠期细胞比例,增强白血病细胞对化疗药物的抗药性。