研究背景与目的:多发性骨髓瘤是克隆性浆细胞在骨髓中无限制性增殖的血液系统恶性肿瘤。蛋白酶体抑制剂在骨髓瘤的耐药机制尚不清楚。外泌体是直径约为40-150 nm的小囊泡体。作为细胞间相互作用的重要方式,外泌体可通过膜受体或内吞的方式进入靶细胞,传递其携带的m RNA、非编码RNA、蛋白质等;或者通过其表面信号分子与靶细胞表面受体结合,产生信号复合体,激活相关分子信号通路等改变受体细胞的行为。长链非编码RNA是转录本长度超过200 nt且没有蛋白质编码功能的RNA分子,具有重要的生物学及病理学功能。长链非编码RNA和肿瘤微环境来源的外泌体在肿瘤发生、发展及耐药中发挥重要作用。多发性骨髓瘤患者骨髓微环境中的间充质干细胞对骨髓瘤细胞的生长至关重要。本研究目的在于探究骨髓间充质干细胞来源的外泌体在骨髓瘤蛋白酶体抑制剂耐药中的作用,并阐明其可能的分子机制。研究方法:1.分离鉴定骨髓间充质干细胞来源的外泌体。PEG法分离外泌体;Western blot鉴定外泌体标记蛋白;纳米颗粒分析仪分析外泌体粒径大小;透射电镜检测其形态和大小。2.采用绿色荧光染料PKH67对外泌体进行荧光染色标记,将标记的外泌体与骨髓瘤细胞共孵育。流式细胞术和激光共聚焦下示踪观察,检测骨髓瘤细胞对间充质干细胞来源外泌体的摄取。3.将硼替佐米耐药和敏感患者骨髓间充质干细胞分泌的外泌体分别与骨髓瘤细胞共孵育,CCK8检测其对骨髓瘤细胞生长活力的影响。4.利用GEO数据库,分析筛选骨髓瘤硼替佐米耐药和敏感患者CD138+细胞中差异表达的lnc RNA和m RNA。利用临床样本及蛋白酶体抑制剂耐药细胞株验证分析结果。5.利用RNAi在硼替佐米耐药患者骨髓间充质干细胞中下调PSMA3-AS1和PSMA3的表达,同时在硼替佐米敏感患者骨髓间充质干细胞中上调PSMA3-AS1和PSMA3的表达。分别分离骨髓间充质干细胞分泌的外泌体,与骨髓瘤细胞共孵育,CCK8检测其对骨髓瘤细胞生长活力的影响。6.利用RNAi在骨髓瘤细胞中下调PSMA3-AS1和PSMA3的表达,荧光底物测定法检测细胞的蛋白酶体胰凝乳样蛋白酶活性,CCK8检测骨髓瘤细胞对蛋白酶体抑制剂敏感性。骨髓瘤细胞中下调PSMA3-AS1的同时过表达PSMA3,荧光底物测定法检测细胞的蛋白酶体胰凝乳样蛋白酶活性,CCK8检测骨髓瘤细胞对蛋白酶体抑制剂敏感性。7.Lnc RNA PSMA3-AS1的特性鉴定:Northern blot检测PSMA3-AS1在骨髓瘤细胞中的表达;5’RACE和3’RACE技术克隆PSMA3-AS1转录本的全长;生物信息学(ORF-finder,CPC和CPAT)分析其非编码特性;通过核质分离和RNA-FISH确定PSMA3-AS1在骨髓瘤细胞中的定位。8.利用核酸酶保护实验和α-鹅膏蕈碱实验研究PSMA3-AS1对PSMA3稳定性的影响。9.利用小鼠骨髓瘤原位模型,在体内水平研究特异性靶向PSMA3-AS1的si RNA对骨髓瘤蛋白酶体抑制剂药物敏感性的作用。10.分别提取硼替佐米耐药和敏感骨髓瘤患者外周血来源的循环外泌体,q RT-PCR检测PSMA3-AS1和PSMA3的表达量,单因素分析和多因素分析判断循环外泌体中PSMA3-AS1和PSMA3的表达量与骨髓瘤患者预后的关系。研究结果:1.骨髓间充质干细胞来源的外泌体可以被骨髓瘤细胞摄取,骨髓瘤细胞对硼替佐米耐药和敏感患者骨髓间充质干细胞来源外泌体的摄取效率相同。2.骨髓间充质干细胞通过外泌体传递耐药性,来源于硼替佐米耐药的多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的外泌体可以降低骨髓瘤细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性。3.利用GEO数据(GSE9782),通过基因富集和基因差异筛选分析,结果表明硼替佐米耐药患者骨髓瘤CD138+细胞中PSMA3和PSMA3-AS1的表达明显高于硼替佐米敏感患者骨髓瘤CD138+细胞中的表达。并且,应用Log-rank检验进行单因素分析,结果表明PSMA3高表达与患者的总体生存期和无进展生存期具有相关性。在12例硼替佐米耐药和45例硼替佐米敏感骨髓瘤患者的临床样本中,与硼替佐米敏感患者相比,PSMA3和PSMA3-AS1在硼替佐米耐药患者的骨髓瘤CD138+细胞和骨髓间充质干细胞中均高表达。蛋白酶体抑制剂耐药细胞株中PSMA3和PSMA3-AS1的表达明显高于其亲本细胞。4.来源于PSMA3-AS1和PSMA3下调的硼替佐米耐药骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的外泌体可以增强骨髓瘤细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性,来源于PSMA3-AS1和PSMA3上调的硼替佐米敏感骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的外泌体可以降低骨髓瘤细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性。5.骨髓瘤细胞中下调PSMA3-AS1和PSMA3使得骨髓瘤细胞的蛋白酶体活性下降,骨髓瘤细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性增强;过表达PSMA3可恢复骨髓瘤细胞对蛋白酶体抑制剂的耐药。6.PSMA3-AS1在骨髓瘤细胞表达;PSMA3-AS1存在两个转录本且不具有蛋白编码能力;核质分离和RNA-FISH结果表明PSMA3-AS1在骨髓瘤细胞胞浆和胞核中都表达。7.PSMA3-AS1通过增强PSMA3前体m RNA的稳定性增加PSMA3表达,后者使蛋白酶体活性增加,进而减低骨髓瘤细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性。8.体内实验结果表明,特异性靶向PSMA3-AS1的si RNA可以增加骨髓瘤对蛋白酶体抑制剂敏感性。9.与硼替佐米敏感患者相比,PSMA3-AS1和PSMA3在硼替佐米耐药骨髓瘤患者外周血的循环外泌体中高表达。单因素分析和多因素分析结果表明,循环外泌体中PSMA3-AS1和PSMA3高表达与患者的总体生存期和无进展生存期密切相关。结论:本研究通过GEO数据分析和临床样本验证筛选出在骨髓瘤蛋白酶体抑制剂耐药细胞中高表达且有功能的lnc RNA,即lnc PSMA3-AS1。PSMA3-AS1和PSMA3可通过外泌体从骨髓间充质干细胞传递至骨髓瘤细胞,使骨髓瘤细胞中PSMA3-AS1和PSMA3的表达增高,蛋白酶体活性增强,细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性降低。同时PSMA3高表达预示着骨髓瘤患者对硼替佐米的反应性较差,患者的总体生存期和无进展生存期较短。分子机制研究发现,PSMA3-AS1是从蛋白酶体亚基PSMA3反义链转录出来的非编码RNA,通过与PSMA3前体m RNA结合形成RNA双链增强PSMA3的稳定性,增加PSMA3的表达,进而减低骨髓瘤细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性。体内研究证明,在体内水平靶向PSMA3-AS1能够增加骨髓瘤对蛋白酶体抑制剂的敏感性,延长整体存活时间。同时,骨髓瘤患者外周血来源的循环外泌体中PSMA3-AS1和PSMA3的表达量与骨髓瘤患者的预后具有相关性。综上所述,PSMA3-AS1不仅可以作为预测蛋白酶体抑制剂治疗反应性的标志物,而且可以作为骨髓瘤蛋白酶体抑制剂耐药的治疗靶点。