帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种神经系统退行性疾病,由中脑黑质多巴胺神经元选择性退行性病变引起,伴随纹状体多巴胺水平降低,随着世界人口老龄化状况日趋严重,PD的发病率也相应增加。虽然PD的脑中病理改变和临床症状已经很好的被阐述,但是引起中脑黑质多巴胺神经元死亡的确切潜在机制仍然不明,所以目前PD的治疗主要集中在症状治疗上,并不能阻止PD患者中脑黑质多巴胺神经元的丢失。所以,研究本病的发病机制并找到新的药物治疗方法,对延缓PD的进展意义重大。PD的发病机制复杂,老龄化、环境因素、遗传因素、慢性炎症反应等均与PD有密切的联系。目前,PD的发病机制还不十分清楚,但是最终都会引起中脑黑质多巴胺神经元的死亡,如果能找到阻止多巴胺神经元死亡的通路,对于探讨PD的发病机制以及治疗都具有重要意义。近年来,Wnt信号通路在PD中的作用愈加被研究者所重视。Wnt信号通路调节中枢神经系统的发育、细胞的增殖、分化、迁移等过程,其在多巴胺能神经元的发育及多巴胺能神经元的损伤中起着保护的作用。Wnt通路有三种,其中最重要的是经典通路即Wnt/β-catenin通路,β-catenin蛋白又是Wnt/β-catenin信号通路的重要的中心环节,通过激活蛋白β-catenin来调控下游靶基因的表达。人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1)是提取自我国传统中草药人参,是人参主要活性成分之一。既往研究人参皂苷Rg1主要集中在抗炎、调节免疫等方面;近年来,一些研究表明Rg1在中枢神经系统疾病的动物模型中起有利作用,并且有研究发现在PD模型中,Rg1可以通过抗凋亡作用、抗氧化应激作用在PD中起保护作用。但是Rg1在PD模型中的保护作用是否通过Wnt/β-catenin通路尚无相关报道。本研究采用具有神经毒性的MPTP建立C57BL/6J小鼠PD模型,采用MPP+作用于PC12细胞建立PD细胞模型,探讨Wnt/β-catenin通路在PD中的作用机制及Rg1对PD的保护作用是通过激活Wnt/β-catenin通路,这在PD的药物治疗上提出了一种新的治疗方法。第一部分人参皂苷Rg1在MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中的中脑黑质多巴胺神经元保护作用目的:探讨人参皂苷Rg1对MPTP诱导的帕金森病小鼠行为学的影响,及人参皂苷Rg1对中脑黑质多巴胺神经元、纹状体TH阳性投射纤维的作用。方法:健康雄性C57BL/6J小鼠60只,随机分为:(1)生理盐水对照组(control);(2)人参皂苷高剂量组(Rg1 20mg/kg);(3)MPTP帕金森病模型组(MPTP 30 mg/kg);(4)MPTP+Rg1 低剂量治疗组(MPTP 30mg/kg+Rg1 5 mg/kg);(5)MPTP+Rg1 中剂量治疗组(MPTP30mg/kg+Rg1 10mg/kg);(6)MPTP+Rg1 高剂量治疗组(MPTP 30 mg/kg+Rg1 20 mg/kg)。我们采用具有神经毒性的MPTP建立帕金森病小鼠模型,将MPTP用双蒸水配置成2 mg/ml的浓度,经腹腔注射到C57BL/6J雄性小鼠体内,30 mg/kg,造模时间为5天。Rg1给药治疗组于MPTP注射2小时前给予相应剂量Rg1,MPTP造模结束后再给予Rg1连续治疗10天。单独Rg1组给予连续15天腹腔注射Rg1。生理盐水对照组给予连续15天腹腔注射生理盐水。造模后观察小鼠行为学变化;采用免疫荧光、western blot和RT-PCR法检测中脑黑质多巴胺神经元酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、多巴胺转运蛋白(dopamine transporters,DAT)的蛋白和mRNA水平变化;免疫荧光方法检测纹状体TH阳性投射纤维的多少。结果:1.MPTP造模组的小鼠行为学检测(爬杆实验、悬挂实验、游泳试验)表明小鼠的运动功能受损,而Rg1治疗组的小鼠运动功能较MPTP组明显改善。2.MPTP组的TH阳性神经元数量较contro1组显著减少,而Rg1治疗组的TH阳性神经元数量较MPTP组明显增加。3.MPTP组的TH、DAT的蛋白和mRNA水平较control组均降低,Rg1治疗组的TH、DAT的蛋白和mRNA水平较MPTP造模组升高。4.和control组比较,MPTP组的纹状体TH阳性投射纤维显著减少,Rg1治疗组的纹状体TH阳性投射纤维较MPTP造模组增多。结论:人参皂苷Rg1可以改善MPTP诱导的PD小鼠模型行为学损伤,减少中脑黑质多巴胺神经元的丢失以及增加纹状体TH阳性投射纤维。第二部分 人参皂苷Rg1在MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中通过Wnt/β-catenin信号通路起保护作用目的:探讨Wnt/β-catenin信号通路在MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中的机制,阐明人参皂苷Rg1能否通过调控Wnt/β-catenin信号通路对MPTP诱导的帕金森病小鼠发挥保护作用。方法:健康雄性C57BL/6J小鼠60只,随机分为:(1)生理盐水对照组(control);(2)人参皂苷高剂量组(Rg1 20 mg/kg);(3)MPTP帕金森病模型组(MPTP 30 mg/kg);(4)MPTP+Rg1 低剂量治疗组(MPTP30mg/kg+Rg1 5mg/kg);(5)MPTP+Rg1 中剂量治疗组(MPTP30mg/kg+Rg1 10mg/kg);(6)MPTP+Rg1 高剂量治疗组(MPTP 30 mg/kg+Rg1 20 mg/kg)。我们采用MPTP建立帕金森病小鼠模型,将MPTP用双蒸水配置成2mg/ml的浓度,经腹腔注射到C57BL/6J雄性小鼠体内,30 mg/kg,造模时间为5天。Rg1给药治疗组于MPTP注射2小时前给予相应剂量Rg1,MPTP造模结束后再给予Rg1连续治疗10天。单独Rg1组给予连续15天腹腔注射Rg1。生理盐水对照组给予连续15天腹腔注射生理盐水。我们采用TUNEL凋亡检测法检测中脑黑质细胞凋亡变化情况,western blot法检测中脑黑质凋亡蛋白caspase-3和抗凋亡蛋白Bcl-xL蛋白水平变化情况;免疫荧光、western blot和RT-PCR法检测中脑黑质多巴胺神经元中Wnt/β-catenin信号通路中标志性分子的蛋白和mRNA水平变化。结果:1.与control组比,MPTP组的小鼠中脑黑质细胞凋亡数量显著增加,而Rg1治疗组的中脑黑质细胞凋亡数量较MPTP造模组明显减少。2.MPTP组的中脑黑质凋亡蛋白caspase-3的蛋白水平较control组显著升高,抗凋亡蛋白Bcl-xL蛋白水平较control组显著下降;而Rg1治疗组的caspase-3的蛋白水平较MPTP组显著降低、Bcl-xL蛋白水平较MPTP组显著升高。3.和control组比,MPTP组的Wnt 1和β-catenin蛋白水平降低,GSK-3β和β-GSK-3β蛋白水平升高;而Rg1治疗组的Wnt 1和β-catenin蛋白水平较MPTP组升高,GSK-3β和p-GSK-3β蛋白水平较MPTP组降低。4.MPTP造模组的Wnt 1和β-catenin的mRNA水平较control组降低,GSK-3β的mRNA水平较对照组升高;而Rg1治疗组的Wnt 1和β-catenin的mRNA水平较MPTP组升高,GSK-3β的mRNA水平较MPTP组降低。5.β-catenin和GSK-3β的免疫荧光水平在多巴胺神经元中的含量与其的蛋白以及mRNA水平趋势一致。结论:MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中脑黑质多巴胺神经元中Wnt/β-catenin信号通路受损,人参皂苷Rg1在MPTP诱导的PD小鼠模型中可以激活Wnt/β-catenin 信号通路。第三部分人参皂苷Rg1在MPP+诱导的PC12细胞帕金森病模型中通过Wnt/β-catenin信号通路起保护作用目的:建立MPP+诱导的PC12细胞帕金森病体外模型,探讨Wnt/β-catenin信号通路在MPP+诱导的PC12细胞模型中的确切机制,在体外阐明Rg1能否通过调控Wnt/β-catenin信号通路对MPP+诱导PC12细胞发挥保护作用。方法:研究Wnt/β-catenin信号通路时分为5组:(1)阴性对照组(Control):加细胞,不加 MPP+、Rg1 和 DKK1;(2)MPP+组(500μM);(3)MPP++Rg1(20 μM)组;(4)MPP++Rg1+DKK1 组;(5)MPP++DKK1 组。我们采用 CKK8检测细胞活性同时筛选出Rg1最佳浓度和作用时间;TUNEL凋亡检测法检测PC12细胞凋亡变化情况;western blot法检测PC12细胞凋亡蛋白casβase-3和抗凋亡蛋白Bcl-xL蛋白水平变化情况;免疫荧光、western blot和RT-PCR法检测PC12细胞中Wnt/β-catenin信号通路中标志性分子的蛋白和mRNA水平变化。结果:1.CKK-8筛选出Rg1 20 μM作用24小时作为进一步检测Wnt/β-catenin信号通路最佳浓度和作用时间。2.MPP+组的PC12细胞凋亡数量较control组明显增多;而Rg1治疗组的PC12细胞凋亡数量较MPP+组明显降低;同时给予DKK1的干预组,Rg1减少细胞凋亡数量效果不明显。3.MPP+组的PC12细胞凋亡蛋白caspase-3蛋白水平较control组显著升高,抗凋亡蛋白Bcl-xL蛋白水平较control组显著降低;而Rg1治疗组的caspase-3蛋白水平较MPP+组显著降低,抗凋亡蛋白Bcl-xL蛋白水平较MPP+组显著升高;同时给予DKK1的干预组,Rg1对凋亡蛋白水平的改变效果不明显。4.和control组比较,MPP+组的PC12细胞Wnt1和β-catenin蛋白水平降低,GSK-3β和p-GSK-3β蛋白水平升高;而Rg1治疗组的Wnt1和β-catenin蛋白水平较MPP+组升高,GSK-3β和p-GSK-3β蛋白水平较MPP+组降低;同时给予DKK1的干预组,Rg1对Wnt/β-catenin信号通路各蛋白水平的改变效果不明显。5.MPP+组的Wnt1和β-catenin的mRNA水平较control组降低,GSK-3β的mRNA水平较control组升高;而Rg1治疗组的Wnt1和β-catenin的mRNA水平较MPP+组升高,GSK-3β的mRNA水平较MPP+组降低;同时给予DKK1的干预组,Rg1对Wnt/β-catenin信号通路各mRNA水平的改变效果不显著。6.β-catenin和GSK-3β的免疫荧光显示在PC12细胞中的含量与其的蛋白以及mRNA水平趋势一致。结论:MPP+诱导的PC12细胞帕金森病模型中Wnt/β-catenin信号通路受损,人参皂苷Rg1在MPP+诱导的PC12细胞PD模型中可以通过Wnt/β-catenin信号通路发挥神经元保护作用。