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肿瘤是困扰人类健康的重大疾病。由于肿瘤的生物学特征的高度复杂性、多样性和可变性，认识肿瘤发生发展机制和寻找治疗肿瘤方法成为遏制肿瘤面临的巨大挑战。随着人们对肿瘤与宿主的关系，特别是机体抗肿瘤免疫应答及肿瘤免疫逃逸机制的认识不断深入，将以免疫细胞、分子、基因为基础的干预手段应用于肿瘤治疗成为肿瘤防治研究的重大热点。肿瘤免疫治疗成为继外科手术、放疗、化疗之后第四类被证明具有显著临床治疗效果及优势的抗肿瘤疗法。近年的研究显示，黑色素瘤抗原基因（melanoma antigen gene, MAGE）因其独特的表达模式，而被认为是肿瘤免疫治疗理想的靶分子。本课题组一直致力于MAGE-A家族在乳腺癌中表达意义的研究。本研究通过制备MAGE-A家族成员MAGE-A9、-A11单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb），利用自制mAb分别检测MAGE-A9、-A11在乳腺癌组织及相应癌旁正常乳腺组织中的表达，分析其表达与乳腺癌临床生物学指标之间的相关性。并通过多重巢式RT-PCR（Multiple nestedRT-PCR）检测MAGE-A基因在乳腺癌外周血中的mRNA水平，从而为MAGE-A家族成为乳腺癌预后监测的特异性指标提供理论依据。主要研究内容和结果如下：第一部分利用自制MAGE-A9、-A11单克隆抗体检测MAGE-A9和-A11在乳腺癌组织中表达及临床意义目的：应用自制MAGE-A9、-A11单克隆抗体检测MAGE-A9和-A11在乳腺癌组织中的表达情况，探讨其表达的临床意义及成为乳腺癌潜在治疗靶点的可能性。方法：1利用抗原表位筛选、表达载体构建、阳性克隆鉴定、阳性克隆质粒提取及转化、诱导表达、Ni柱亲和纯化、动物免疫、细胞融合和ELISA进行单抗筛选的方法进行MAGE-A9和-A11mAb的制备。2应用Western blot检测mAb的特异性。3应用免疫组织化学法在睾丸组织中验证mAb特异性。4在多种肿瘤组织中用自制mAb验证MAGE-A9和-A11的表达。5应用免疫组织化学法检测MAGE-A9和MAGE-A11蛋白在乳腺癌及其相应癌旁组织中的表达并分析其表达与乳腺癌临床生物学指标之间的相关性。结果：1成功获得MAGE-A9mAb和MAGE-A11mAb。2利用自制MAGE-A9mAb检测到MAGE-A9蛋白在正常睾丸组织和多种癌组织包括食管癌、胃癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌和乳腺癌中均有表达。在正常睾丸组织尤其精原细胞和精母细胞核中有显著表达。MAGE-A9蛋白在乳腺癌组织中主要定位于细胞质，部分定位于细胞核。60例乳腺癌旁正常组织中未发现MAGE-A9蛋白表达，乳腺癌组织中MAGE-A9的阳性率为56.7%（34/60）。在乳腺癌组织中，MAGE-A9蛋白表达率与HER-2和ER表达率存在相关性（χ~2=6.058，P=0.014）、（χ~2=4.344，P=0.037），且MAGE-A9蛋白表达率随HER-2和ER表达率的增加而增加，提示MAGE-A9蛋白有可能是乳腺癌的治疗及预后监测的重要参考指标。MAGE-A9蛋白表达与乳腺癌患者的年龄（χ~2=2.986，P=0.225）、病理类型（χ~2=0.162，P=0.983）、组织学分级（χ~2=0.873，P=0.646）、临床分期（χ~2=0.471，P=0.790）、肿瘤大小（χ~2=0.727，P=0.695）、淋巴转移（χ~2=0.090，P=0.764）、PR（χ~2=0.463，P=0.463）及AIB-I（χ~2=0.558，P=0.455）表达均无相关性。3利用自制MAGE-A11mAb检测到MAGE-A11蛋白在正常睾丸组织和多种癌组织包括食管癌、胃癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌和乳腺癌中均有表达。在正常睾丸组织尤其精原细胞和精母细胞核中有显著表达。MAGE-A11蛋白在乳腺癌组织中主要定位于细胞质，部分定位于细胞核。60例乳腺癌旁正常组织中未发现MAGE-A11蛋白表达，乳腺癌组织中MAGE-A11的阳性率为53.3%（32/60）。在乳腺癌组织中，MAGE-A11蛋白表达阳性率与HER-2和ER表达率存在相关性（χ~2=11.082，P=0.01）、（χ~2=4.286，P=0.038），且MAGE-A11蛋白表达率随HER-2和ER表达率的增加而增加，提示MAGE-A11蛋白有可能是乳腺癌的治疗及预后监测的重要参考指标。MAGE-A11蛋白表达与乳腺癌患者的年龄（χ~2=0.375，P=0.837）、病理类型（χ~2=0.332，P=0.847）、组织学分级（χ~2=0.460，P=0.795）、临床分期（χ~2=1.283，P=0.527）、肿瘤大小（χ~2=0.662，P=0.718）、淋巴转移（χ~2=0.357，P=0.550）、PR（χ~2=1.558，P=0.212）及AIB-I（χ~2=0.577，P=0.448）表达均无相关性。460例乳腺癌组织标本中，MAGE-A9、-A11蛋白表达呈均匀分布，MAGE-A9、MAGE-A11蛋白在乳腺癌组织中的表达阳性率分别为56.7%（34/60）、53.3%（32/60）。在60例乳腺癌标本中，MAGE-A9、MAGE-A11蛋白同时表达的有28例，占46.7%（28/60）。60例乳腺癌组织中两种蛋白阳性表达率之间无明显差异（χ~2=0.323，P=0.570>0.05）。结论：作为肿瘤特异性抗原，MAGE-A9和-A11有可能是乳腺癌预后不良的重要标记。第二部分乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞中MAGE-A基因的表达目的：探讨MAGE-A基因在乳腺癌外周血循环肿瘤细胞中的表达及与预后的相关性。方法：采用多重巢式RT-PCR（multiplex nested RT-PCR）方法检测106例乳腺癌患者和30例健康人外周血中MAGE-A基因的mRNA表达水平，并利用酶切的方法鉴定该家族成员MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、和-A6的表达情况。结果：1MAGE-A基因在乳腺癌患者外周血中表达率为40%（43/106）。应用每一种基因所对应的限制性内切酶Bcl I、EcoRI、Eco47III、Sph I和Afl III进行酶切实验，观察到MAGE-A基因在乳腺癌外周血中的表达顺序为A2>A3>A4>A1>A6。MAGE-A1的表达率为10%（11/106），MAGE-A2的表达率21%（22/106），MAGE-A3的表达率为15%（16/106），MAGE-A4的表达率为13%（14/106），MAGE-A6的表达率为6%（6/106）。2（828/106）个乳腺癌患者外周血中只表达一种MAGE-A基因，10（10/106）个乳腺癌患者外周血中表达两种MAGE-A基因，2（2/106）个乳腺癌患者外周血中表达三种MAGE-A基因，0（0/106）个乳腺癌患者外周血中同时表达四种MAGE-A基因，3（3/106）个乳腺癌患者外周血中同时表达五种MAGE-A基因（GsY、 CfJ、QxR）。2MAGE-A基因的表达与多个临床指标具有相关性。MAGE-A基因的表达率随乳腺癌患者年龄的增加而增加（χ~2=26.047，P=0.000）。MAGE-A基因的表达率随乳腺癌患者组织学分级的增加而增加（χ~2=5.709，P=0.017）。存在远端转移的乳腺癌患者MAGE-A基因的表达率显著高于非远端转移的患者（χ~2=15.402，P=0.000）。存在远端转移的乳腺癌患者MAGE-A1基因的表达率显著高于非远端转移的患者（χ~2=12.981，P=0.000）。MAGE-A2基因的表达率随乳腺癌患者临床分期的递增而增加（χ~2=12.218，P=0.001），MAGE-A2基因的表达率随乳腺癌患者肿瘤的增大而增加（χ~2=11.753，P=0.003）。MAGE-A4基因的表达率随乳腺癌患者的年龄的增加而增加（χ~2=6.456，P=0.04）。提示MAGE-A基因在乳腺癌外周血中mRNA水平是监测乳腺癌预后和转移的重要参考指标。结论：1MAGE-A基因在乳腺癌外周血的表达有可能作为检测乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的标记。2外周血中MAGE-A1、-A2和-A4基因的表达可能与乳腺癌的不良预后相关，可作为监测乳腺癌预后的重要指标。