猪在机体大小、器官解剖结构、遗传和免疫学等方面与人类非常接近,同时猪又是全世界广泛饲养的肉用家畜,伦理限制相对较少,故猪被认为是最具潜力的生物医学模型动物,但因猪没有真正的胚胎干细胞而限制了猪在这些领域的应用。在过去的二十多年中,研究人员在人和啮齿类动物胚胎干细胞的研究基础上对猪多能干细胞的分离和培养进行了广泛地探索。猪胚胎来源的多能干细胞系的研究始于20世纪90年代初,Evans等和Strojek等将猪植入前胚胎作为原代材料,在已有的小鼠胚胎干细胞的研究基础上探讨了猪胚胎干细胞培养过程中涉及的饲养层细胞类型、胚胎胚龄、全胚或分离内细胞团对原代克隆生成的影响,并初步描述了猪类胚胎干细胞的特征。此后研究人员针对猪胚胎干细胞建系的各种影响因素进行了更为全面的研究,主要包括建系所用胚胎的胚龄、饲养层细胞的种类、胚胎接种方式、胚胎来源和培养体系等,但目前仍然面临几个以下问题:（1）获得的细胞系均为猪胚胎干细胞样的细胞系;（2）各细胞系的多能性鉴定指标参差不齐;（3）无有效的培养体系,建系效率低;（4）细胞系体内和体外分化能力弱,很难形成畸胎瘤;（5）获得的细胞系很难进行基因编辑操作,携带的外源基因不能稳定表达;（6）不能获得生殖系嵌合动物。本研究针对这些问题进行了以下四部分的探索:（1）探索氧气浓度、培养液和胚胎胚龄对猪胚胎干细胞建系所产生的影响;（2）探索猪多能干细胞的多能性特征及其体内和体外分化能力;（3）探索猪胚胎来源的干细胞是否可用于基因编辑操作;（4）探索猪胚胎来源的干细胞获得克隆动物和嵌合动物的可行性。经过对上述内容的研究,结果显示:（1）我们能够在新研发的MXV培养液和5%氧气浓度的培养体系下从5.5天的猪体外受精囊胚中分离培养获得猪多能干细胞系（porcine PluripotentStemCells,pPSCs）。pPSCs已在体外培养超过75代,其克隆形态和人胚胎干细胞相似。对pPSCs的鉴定结果表明,pPSCs呈碱性磷酸酶阳性,具有正常核型,表达经典的多能性标记OCT4、SOX2和NANGO。拟胚体自发分化的结果和畸胎瘤的结果均证明pPSCs具有体外和体内分化能力。携带外源基因fuw-Dsred的pPSCs细胞系（pPSC-FDs）能够在稳定传代的同时表达DsRed和多能性标记。把pPSC-FDs作为供体细胞用于体细胞核移植后,11.52%的重构胚胎可以在体外培养至囊胚期。将pPSC-FDs注射到4.5天的小腔囊胚中,pPSC-FDs细胞能够参与到体外胚胎的发育中,将嵌合胚胎移入到受体母猪中时,pPSC-FDs细胞能够嵌合到妊娠50天胎儿的内脏组织和胎盘组织中。（2）MXV培养液成分极其复杂,该培养环境不利于对pPSCs多能性维持机制的进一步研究,因此,我们对MXV进行优化后获得了一个新的成分明确的无血清培养基（KO培养基）。在KO培养体系中,我们可以从猪5.5天的体外受精胚胎中分离培养获得猪多能干细胞系pPSC-KOs,该细胞系多能性正常,在体外可自发分化为三胚层细胞系,可向神经方向和成骨方向定向诱导分化,能够进行转基因操作,可嵌合到体外发育的胚胎中。综上,这些结果显示我们获得的两个猪多能干细胞系（pPSCs和pPSC-KOs）将会成为猪遗传工程和阐释猪特异性多能性调控分子机制的有效细胞系。通过对上述研究内容的总结,具体结论有:（1）通过优化影响猪胚胎干细胞建系的因素（氧气浓度,培养液和胚胎胚龄）,我们培养获得了可持续传代的pPSCs,pPSCs具有与人和小鼠胚胎干细胞类似的多能性。（2）获得的pPSCs具有良好的体外和体内分化能力,能够稳定携带外源基因;将pPSCs作为供体细胞用于体细胞核移植生产克隆胚胎时,重构胚胎可以在体外培养至囊胚期;将pPSCs用于囊胚嵌合时,pPSCs具有胎盘和内脏嵌合能力。（3）通过对MXV培养液的成分逐一撤除,我们最终得到了成分明确的无血清培养基（KO）,该培养体系下建立的pPSC-KOs细胞系的多能性与小鼠胚胎干细胞的多能性更相近。（4）获得的pPSC-KOs具有良好的体外自发分化和定向诱导分化能力,能够稳定携带外源基因,用作核移植供体细胞后重构胚胎能够发育至囊胚期,能够嵌合到体外培养的胚胎中。（5）不同培养体系下（MXV和KO）培养获得的猪多能性干细胞（pPSCs和pPSC-KOs）主要依赖的信号通路具有差异性,pPSCs同时依赖FGF和LIF两条信号通路,而pPSC-KOs则更倾向于依赖LIF信号通路。