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目的第一部分抗冷冻蛋白AFPⅢ对小鼠2-细胞胚胎的冷冻保护作用将抗冷冻蛋白AFPⅢ应用于小鼠2-细胞胚胎的玻璃化冷冻保存,观察其对细胞微丝骨架结构是否有保护作用和胚胎冷冻复苏后发育潜能。第二部分抗冷冻蛋白AFPⅢ对小鼠卵母细胞的冷冻保护作用观察玻璃化冷冻对小鼠MⅡ期卵母细胞的损伤及抗冷冻蛋白AFPⅢ是否在冷冻过程中对其细胞结构和功能起保护作用。方法第一部分抗冷冻蛋白AFPⅢ对小鼠2-细胞胚胎的冷冻保护作用1.2-细胞胚胎获取：健康性成熟昆明系雌性小鼠,8-12周龄,质量30-35g,腹腔注射PMSG10IU/只,48h后腹腔注射HCG10IU/只,与雄性性成熟昆明小鼠按照1：1合笼过夜,次日清晨观察雌鼠阴道栓,将有阴道栓的雌鼠和雄鼠分开饲养,在注射HCG后的46-48h后颈椎脱臼法处死雌性小鼠,在体视镜下分离出输卵管,用无菌针头刺破输卵管壶腹膨大处,获取2-细胞小鼠胚胎。2.分组：将获得1200枚胚胎随机分为新鲜对照组、玻璃化冷冻组及添加AFPⅢ (500ng/mL)玻璃化冷冻组,每组400枚,200枚继续培养观察发育潜能,200枚行微丝免疫荧光染色。3.玻璃化冷冻复苏：2-细胞胚胎采用玻璃化冷冻,冷冻复苏存活的胚胎继续培养观察其囊胚形成情况,并统计冷冻组复苏率和三组的囊胚形成率。4.胚胎微丝观察：固定、透化、封闭的胚胎加入预热到37℃的0.1ug/mLFITC-结合的鬼笔环肽,免疫荧光染色60分钟,统计三组微丝完整比率。5.统计学分析：采用SPSS17.0统计软件进行数据分析,计量资料采用t检验,计数资料统计学分析采用X1检验,检验标准均为0.05,P<0.05为差异有统计学意义。第二部分抗冷冻蛋白AFPⅢ对小鼠卵母细胞的冷冻保护作用1.卵母细胞获取：健康性成熟昆明雌性小鼠,8-12周龄,质量30-35g,腹腔注射PMSG10IU/只,48h后腹腔注射HCG10IU/只,18-20h后颈椎脱臼法处死小鼠,在体视镜下分离卵巢、部分子宫和输卵管,刺破输卵管壶腹部获取成熟卵母细胞(MII期)。2.分组：将获取卵母细胞1200枚随机分为IV组,分别为新鲜对照组,添加冷冻保护新鲜组,玻璃化冷冻组,添加AFPⅢ (500ng/mL)玻璃化冷冻组,每组300枚,其中100枚进行体外授精观察其囊胚形成率,100枚行微管微丝免疫荧光染色,100枚行实时定量PCR分析相关基因的表达。3.玻璃化冷冻复苏：卵母细胞行玻璃化冷冻,玻璃化冷冻组复苏存活的卵母细胞行体外受精。4.精子获取：雄性小鼠附睾尾部获取精子悬液,进行梯度离心处理,在倒置显微镜下将已获能的精子至于G-IVF培养液中并调整密度为3-6×106/mL。5.体外受精：向含有精子的培养液中添加卵母细胞,37℃、6%CO2培养箱中共同孵育,受精后5-9h观察双原核出现情况,于受精后第2、3、4、5天分别观察2细胞、4细胞、8细胞及囊胚的发育情况,并计算受精率,囊胚形成率。6.微管蛋白观察：固定、透化、封闭后的卵母细胞加入预热到37℃,1：250稀释的抗小鼠a-tubulin单克隆抗体,4℃封闭过夜,37℃、1：100稀释的FITC结合的山羊抗兔IgG,37℃培养箱中避光染色120min。7.微丝观察：将已固定、透化、封闭的卵母细胞、2细胞、4细胞、8细胞和囊胚加入预热到37℃、0.1ug/mLFITC-结合的鬼笔环肽,37℃、6%CO：培养箱中避光染色60min。8.染色体观察：经微管、微丝染色后清洗的卵母细胞在室温下置于DAPI中避光反染3min。.9.荧光实时定量PCR测定基因的表达：通过卵母细胞的裂解、分离、.沉淀、RNA的洗脱、再溶解；紫外分光光度仪测量RNA的纯度和浓度,逆转录,实时定量PCR (10μL体系)方法来测定基因Mad2、Eg5、Cenp-e和Cirbp的相对表达量。10.统计学分析：采用SPSS17.0统计软件进行数据分析,计量资料采用t检验,计数资料统计学分析采用X2检验,四组基因表达量用GraphPad Prism5软件U检验进行分析,mRNA提取实验至少重复三次。检验标准均为0.05,P<0.05为差异有统计学意义。结果第一部分抗冷冻蛋白AFPⅢ对小鼠2-细胞胚胎的冷冻保护作用1.添加AFPⅢ玻璃化冷冻组胚胎复苏率高于玻璃化冷冻组,差异有统计学意义(P<0.05)。2.新鲜对照组和添加AFPⅢ玻璃化冷冻组囊胚形成率、微丝完整胚胎比率均高于玻璃化冷冻组,差异有统计学意义(P<0.05)；新鲜对照组和添加AFPⅢ玻璃化冷冻组之间无统计学意义(P>0.05)。第二部分抗冷冻蛋白AFPⅢ对小鼠卵母细胞的冷冻保护作用1. AFPⅢ玻璃化冷冻组卵母细胞纺锤体、微丝和染色体完整的比率高于玻璃化冷冻组,差异有统计学意义(P<0.05),新鲜对照组和添加冷冻保护剂新鲜组之间没有统计学意义(P>0.05),但是显著高于后两组且有统计学意义(P<0.05)。2.新鲜对照组、添加冷冻保护剂新鲜组及AFPⅢ玻璃化冷冻组Mad2、CENP-E mRNA相对表达量高于玻璃化冷冻组,差异有统计学意义(P<0.05)；然而玻璃化冷冻组CIRP、Eg5的mRNA相对表达量高于其他三组,且有统计学意义(P<0.05),其他三组表达量没有统计学意义(P>0.05)。3.新鲜对照组、添加冷冻保护剂新鲜组的受精率高于其他两组,差异有统计学意义(P<0.05),而AFPⅢ玻璃化冷冻组复苏率、受精率均高于玻璃化冷冻组,且有统计学意义(P<0.05),前两组之间没有显著性差异(P>0.05)。四组的囊胚形成率没有统计学意义(P>0.05)。结论第一部分抗冷冻蛋白AFPⅢ对小鼠2-细胞胚胎的冷冻保护作用1.添加AFPⅢ玻璃化冷冻组胚胎复苏率高于玻璃化冷冻组。2.新鲜对照组和添加AFPⅢ玻璃化冷冻组囊胚形成率、微丝完整胚胎比率均高于玻璃化冷冻组。3.新鲜对照组和添加AFPⅢ玻璃化冷冻组之间无显著性差异。第二部分抗冷冻蛋白AFPⅢ对小鼠卵母细胞的冷冻保护作用1. AFPⅢ玻璃化冷冻组卵母细胞纺锤体、微丝和染色体完整的比率高于玻璃化冷冻组,新鲜对照组和添加冷冻保护剂新鲜组之间没有显著性差异,但是显著高于后两组。2.新鲜对照组、添加冷冻保护剂新鲜组及AFPⅢ玻璃化冷冻组Mad2、CENP-E mRNA相对表达量高于玻璃化冷冻组；然而玻璃化冷冻组CIRP、Eg5的mRNA相对表达量高于其他三组,其他三组表达量没有显著性差异。3.新鲜对照组、添加冷冻保护剂新鲜组的受精率高于其他两组,而AFPⅢ玻璃化冷冻组复苏率、受精率均高于玻璃化冷冻组,前两组之间没有显著性差异。四组的囊胚形成率没有显著性差异。