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具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum,F.nucleatum）作为一种革兰氏阴性专性厌氧菌,在口腔生物膜结构中起整合作用,可通过多种黏附素桥接生物膜中的不同微生物。F.nucleatum感染除了导致口咽部疾病外,还会导致口腔外的多种疾病包括:心包炎、脑脓肿、阑尾炎、骨髓炎和盆腔炎等。近些年的研究表明F.nucleatum能够在结直肠癌组织中富集,影响结直肠癌进展的多个阶段,包括促进肿瘤细胞增殖、肿瘤免疫逃逸、复发和化疗耐药性。F.nucleatum可作为潜在的生物标志物用于结直肠癌的诊断与预后评估,也是治疗结直肠癌的潜在靶点。在所有恶性肿瘤中,结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）的发病率位居第三,死亡率位居第二。加强具核梭杆菌的研究,对理解结直肠癌的发生、转移与复发的分子机制具有十分重要的意义。人体肠道内微生物的种类与数量繁多,环境复杂,且F.nucleatum生存条件苛刻,因此其作为入侵细菌,在肠道定植面临种种困难。自噬（Autophagy）能维持细胞内稳态,也是机体固有免疫应答中对抗病原微生物感染的重要手段之一。自噬的抑制会导致机体无法清除已感染的病原微生物,造成其持续性感染。F.nucleatum在迁移到人体肠道后,能够通过其特有的机制躲避免疫系统的清除,这一过程与自噬抑制密切相关。微生物感染是肿瘤发生发展的重要因素,F.nucleatum在胞内持续性感染能启动肿瘤信号通路,促进肠上皮细胞向肿瘤细胞转化。对F.nucleatum胞内免疫逃逸和促肿瘤机制的研究,能够帮助我们更好地理解F.nucleatum与结直肠癌之间的相互作用,从而达到精准防治结直肠癌的目的。本研究前期通过miRNA表达谱芯片筛选发现,miR-31与F.nucleatum在结直肠上皮细胞持续性感染和促进肿瘤进程中发挥重要作用。在此基础上,拟在细胞感染模型、动物感染模型和致瘤模型中深入研究miR-31介导F.nucleatum在结直肠上皮细胞中持续性感染与促进肿瘤进程的分子机制。【研究目的】（1）明确F.nucleatum通过miR-31促进其在结直肠上皮细胞中持续性感染及肿瘤进程的作用;（2）探讨miR-31在F.nucleatum抑制宿主细胞自噬流的分子机制;（3）探讨miR-31在F.nucleatum促进结直肠癌进程中的分子机制。【研究方法】1.miR-31介导F.nucleatum在结直肠上皮细胞中持续性感染及促进肿瘤进程的作用研究（1）基因芯片筛选临床标本和细胞模型中差异表达的miRNA分子,荧光定量PCR检测结直肠癌临床样本中F.nucleatum的16s RNA和miR-31的表达,分析F.nucleatum、miR-31与结直肠癌之间的关系。（2）建立F.nucleatum感染NCM460细胞模型,透射电镜观察F.nucleatum感染后在胞内的定植与生存情况;通过胞内生存实验绘制F.nucleatum感染细胞后的生长曲线和miR-31对其胞内增殖的调控作用。利用细胞迁移侵袭实验,证明F.nucleatum感染后对细胞迁移和侵袭能力的影响。（3）建立F.nucleatum感染C57BL/6小鼠模型,Lumnix技术检测小鼠血清中细胞因子的表达水平;同时对不同感染因素的小鼠结直肠组织进行HE染色观察,并作病理评分,分析F.nucleatum感染引起的组织病理损伤情况。（4）建立APCmin/+小鼠致瘤模型,采用灌肠给菌和腹腔注射miR-31 inhibitor腺病毒,观察偶氮甲烷诱导的结直肠肿瘤数量,通过肿瘤数量、体积和生存率来评价F.nucleatum及miR-31促进结直肠癌的作用。2.F.nucleatum通过miR-31抑制宿主自噬流导致持续性感染的作用机制研究（1）激光共聚焦与Western Blot检测F.nucleatum感染NCM460细胞系后自噬水平的改变;WB检测MAP1LC3B-II与SQSTM 1蛋白的表达含量来判断自噬流的通畅情况;NCM460细胞转染mRFP-GFP-LC3双标质粒后,使用共聚焦显微镜检测自噬流。（2）生物信息学预测miR-31的下游靶基因,通过miR-31增强或抑制实验和双荧光素酶报告实验,验证miR-31对STX12的调控关系,并通过WB与激光共聚焦确认miR-31对自噬流的调控作用。（3）STX12 siRNA转染NCM460细胞饥饿诱导自噬后,观察细胞内自噬标志蛋白的表达变化;转染GFP-LC3质粒后,观察细胞内自噬点数量的变化,以此来判断自噬体与溶酶体融合的情况。Alexa Flour555标记溶酶体标记物LAMP1,GFP标记自噬体标记物LC3,观察敲除STX12后,细胞内自噬体与溶酶体的融合情况;使用慢病毒构建抑制miR-31或过表达STX12的细胞系,观察F.nucleatum在胞内的定植情况。（4）建立F.nucleatum感染C57BL/6小鼠模型,采用灌肠给菌和腹腔注射miR-31inhibitor腺病毒,通过对小鼠结直肠组织病理分析和qPT-PCR检测F.nucleatum,观察F.nucleatum通过miR-31介导的持续性感染作用。3.F.nucleatum通过miR-31激活RAS通路促进结直肠癌进程的作用机制研究（1）利用双荧光素酶实验验证miR-31对RASA1调控的特异性;（2）WB检测F.nucleatum感染细胞模型与临床标本中肿瘤组织与对应正常组织中RASA1的含量,判断RAS通路的激活情况。（3）利用CCK-8细胞增殖实验,观察miR-31对F.nucleatum感染后对细胞增殖能力的影响。（4）激光共聚焦观察F.nucleatum感染NCM460和SW480细胞后对细胞骨架蛋白E-cadherin、F-actin和Tublin的影响。【研究结果】1.具核梭杆菌感染引起宿主细胞miR-31表达上调与其持续性感染和结直肠肿瘤进程相关（1）基因芯片筛查25例临床标本,筛选得到49个与F.nucleatum感染高度相关的差异miRNA,其中miR-31-5p（miR-31）表达倍数最高。qRT-PCR验证结果显示miR-31与F.nucleatum在结直肠肿瘤中丰度升高,且F.nucleatum富集与miR-31高表达存在正相关性。（2）miR-31促进了F.nucleatum在NCM460内的定植;转染miR-31抑制剂,F.nucleatum在宿主细胞内的增殖明显受抑。F.nucleatum感染能促进NCM460细胞迁移和侵袭能力显著提高。（3）F.nucleatum感染能诱导C57BL/6小鼠结直肠组织炎症反应,分泌大量促炎性细胞因子并对小鼠结直肠组织造成严重的损伤。（4）F.nucleatum感染能促进APCMin/+小鼠AOM诱导的结直肠肿瘤的生成,给予miR-31 inhibitor腺病毒感染,小鼠的生存率得到提升。2.具核梭杆菌通过miR-31抑制宿主细胞自噬流引起持续性感染（1）F.nucleatum感染能增加NCM460细胞内自噬体的形成,MAP1LC3B-II与SQSTM 1表达含量显著提高。激光共聚焦和Western Blot表明,F.nucleatum感染能够通过miR-31阻断细胞内自噬流的通畅。（2）生物信息学预测和双荧光素酶报告实验证实STX12是miR-31的下游靶基因;miR-31能通过调控STX12抑制自噬体和溶酶体的融合。（3）抑制STX12有利于F.nucleatum的在NCM460细胞的定植和持续性感染。（4）miR-31能促进F.nucleatum在小鼠肠道内定植。3.具核梭杆菌通过miR-31介导RAS通路激活促进结直肠癌进程（1）生物信息学预测和双荧光素酶报告实验证实RASA1是miR-31的下游靶基因;F.nucleatum+结直肠癌临床标本中RASA1的表达含量与miR-31呈显著负相关。（2）F.nucleatum感染通过miR-31抑制NCM460细胞内RASA1的表达。（3）F.nucleatum感染通过miR-31显著提高NCM460和SW480的增殖能力。（4）F.nucleatum感染通过miR-31促进NCM460细胞向间质细胞转化:细胞骨架蛋白E-cadherin表达含量显著降低;Tubulin断裂聚集形成团块状结构;F-actin结构紊乱,细胞形成丝状或板状伪足。【主要结论】（1）F.nucleatum能通过诱导宿主miR-31的表达上调,介导其在结直肠上皮细胞中持续性感染及促进肿瘤进程。（2）miR-31通过STX12抑制自噬体与溶酶体融合,阻断自噬流,逃逸免疫清除,实现F.nucleatum在宿主细胞内持续性感染。（3）miR-31通过抑制RASA1的表达激活宿主细胞RAS信号通路促进F.nucleatum感染引起的结直肠肿瘤进程。【研究意义】本研究以miR-31为切入点,探讨了F.nucleatum与宿主的相互作用在其持续性感染与肿瘤发生中的作用机制;为利用F.nucleatum作为潜在靶点进行结直肠癌的临床诊断、预后评估以及精准防治提供了理论依据,同时也为其他病原微生物与肿瘤发生关系的研究提供了新的思路。