他克莫司联合罗格列酮对TNF-α诱导的HaCaT细胞体外增殖及相关炎症因子表达影响的研究

来源 :徐州医学院 徐州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yangsh1967
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目的:探讨他克莫司与罗格列酮单独及联合应用对TNF-α诱导的角质形成细胞体外增殖及相关炎症因子表达的影响,并观察他克莫司与罗格列酮联合应用的作用效果,为临床应用他克莫司联合罗格列酮治疗特殊人群银屑病如银屑病合并糖尿病提供实验和理论依据。  方法:以TNF-α诱导的永生化人角质形成细胞株HaCaT细胞为银屑病表皮角质形成细胞模型。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度他克莫司、罗格列酮单独及联合作用24h、48h、72h后对HaCaT细胞体外增殖的抑制作用;Griess法检测不同浓度他克莫司、罗格列酮单独及联合作用4h、8h、12h、24h、48h后,HaCaT细胞NO的表达变化;半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫荧光(IF)法测定他克莫司与罗格列酮单独及联合应用对HaCaT细胞LL37表达水平的影响;免疫细胞化学(ICC)、Western blot(WB)法检测他克莫司与罗格列酮单独及联合应用对HaCaT细胞NF-κB表达的影响;Western blot(WB)法检测HaCaT细胞ICAM-1的表达变化。  结果:1.MTT法检测结果显示,50U/ml TNF-α能显著促进HaCaT细胞体外增殖,与溶媒组相比差异有统计学意义(P<0.05)。10μmol/L罗格列酮、40μmol/L罗格列酮、10μmol/L他克莫司、10μmol/L罗格列酮联合10μmol/L他克莫司、40μmol/L罗格列酮联合10μmol/L他克莫司作用48h后,对TNF-α诱导的HaCaT细胞体外增殖的抑制率分别为:(18.355±2.494)%、(29.775±6.418)%、(40.827±9.497)%、(52.252±8.022)%、(63.250±6.275)%。结果表明,他克莫司与罗格列酮单独及联合应用均能显著抑制TNF-α诱导的HaCaT细胞体外增殖,40μmol/L罗格列酮与10μmol/L他克莫司联合应用对TNF-α诱导的HaCaT细胞体外增殖的抑制作用最强。2.Griess法检测结果表明,空白组、溶媒组、TNF-α诱导组以及10μmol/L罗格列酮、40μmol/L罗格列酮、10μmol/L他克莫司、10μmol/L罗格列酮联合10μmol/L他克莫司、40μmol/L罗格列酮联合10μmol/L他克莫司作用于TNF-α诱导的HaCaT细胞48h后,NO(μmol/L)的表达情况分别为:3.359±0.379、3.346±0.199、6.872±0.500、6.231±0.319、5.321±0.504、4.615±0.275、3.782±0.750、3.013±0.245。经TNF-α诱导的HaCaT细胞NO分泌量显著高于溶媒组(P<0.05)。他克莫司与罗格列酮单独应用均可不同程度地抑制TNF-α诱导的HaCaT细胞NO的分泌。与他克莫司、罗格列酮单独应用相比,二者联合应用对HaCaT细胞NO分泌的抑制作用更强(P<0.05)。3.RT-PCR及免疫荧光检测结果表明,LL37主要表达于HaCaT细胞胞浆,TNF-α可显著上调HaCaT细胞中LL37的表达,与溶媒组相比差异有统计学意义(P<0.05)。与TNF-α诱导组相比,他克莫司、罗格列酮单独及联合应用均可致LL37表达下调,且他克莫司、罗格列酮联合应用比相同浓度单独应用的作用效果更强(P<0.05)。4.免疫细胞化学及WB结果显示,TNF-α诱导的HaCaT细胞中可见NF-κB的大量表达,阳性表达主要位于HaCaT细胞胞核,部分细胞胞浆也有表达。他克莫司、罗格列酮单独及联合应用均可不同程度地抑制HaCaT细胞NF-κB的表达,与TNF-α诱导组相比差异均有统计学意义(P<0.05),且他克莫司、罗格列酮联合应用比相同浓度单独应用的作用效果更强(P<0.05)。5.ICAM-1测定结果显示,TNF-α可显著上调HaCaT细胞中ICAM-1的表达,他克莫司、罗格列酮单独及联合应用均可下调其表达,与TNF-α诱导组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。他克莫司与罗格列酮联合应用对HaCaT细胞ICAM-1表达的抑制作用比相同浓度单独应用的作用效果更强(P<0.05)。  结论:1.TNF-α能显著促进HaCaT细胞的体外增殖,上调HaCaT细胞NO、NF-κB、LL37及ICAM-1的表达。2.他克莫司、罗格列酮单独及联合应用均能显著抑制TNF-α诱导的HaCaT细胞体外增殖,抑制HaCaT细胞NO的分泌,下调HaCaT细胞ICAM-1、NF-κB和LL37的表达。3.他克莫司与罗格列酮联合应用比相同浓度他克莫司、罗格列酮单独应用对HaCaT细胞体外增殖及炎症因子表达的抑制作用更强。
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