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背景:在中枢神经系统中,缝隙连接蛋白43(connexin,Cx43)为缝隙连接蛋白的主要的组成成分,Cx43可实现细胞与细胞之间的通讯(特别是神经元与星形胶质细胞,星形胶质细胞与少突胶质细胞之间),并在离子传递、底物交换和传递信息方面起到重要的作用。而缺血性卒中发生后,缝隙连接功能异常,既能传递死亡信号和钙超载,也能传递一些神经保护因子,这一作用十分重要,然而机制尚不明确。近些年的研究表明,缺血后星形胶质细胞细胞膜上Cx43的含量降低,并且内化增加。此外亦有研究证实,在生理条件下内化后的Cx43经自噬选择性降解。以上前期研究的结果为本研究提供了新的思路,即探究缺血后内化的Cx43是否经选择性自噬降解及其详细降解机制,以及干预Cx43自噬降解对神经免疫和细胞凋亡的影响,这使得我们可以通过了解详细的分子机制来寻找更多的治疗干预靶点。目的:探讨脑缺血后Cx43的去向,观察Cx43是否通过细胞自噬途径降解;明确脑缺血后Cx43自噬降解的分子机制;观察促进Cx43自噬降解对脑缺血造成的神经免疫和细胞凋亡的影响,从而判断干预Cx43自噬降解能否能成为治疗缺血性脑损伤的新靶点。方法:体外实验采用原代培养新生C57BL/6小鼠星形胶质细胞和HeLa细胞系,通过制作糖氧剥夺(Oxygen-glucose deprivation,OGD)模型模拟脑缺血损伤。体内实验选用体重20-25g的成年C57BL/6雄性小鼠,通过大脑中动脉栓塞模型(Middle cerebral artery occlusion model,MCAO)模拟脑缺血损伤。1、缺血条件下Cx43经自噬降解:设置小鼠原代星形胶质细胞对照组和OGD组,应用免疫蛋白印记法(Western blotting,WB)研究在小鼠星形胶质细胞中缺血前后Cx43以及磷酸化Cx43(S368)的表达,应用免疫荧光(Immunofluorescence,IF)研究缺血前后小鼠星形胶质细胞中Cx43与LC3b的共定位情况;使用siRNA敲低自噬相关蛋白Atg5在原代小鼠星形胶质细胞中的表达,设置对照组、Atg5敲低组、OGD组和Atg5敲低+OGD组,通过Western blotting检测缺血前后Cx43以及磷酸化Cx43(S368)的表达;体内实验设置假手术组和MCAO组,通过IF研究MCAO前后小鼠脑冰冻切片中Cx43与LC3b的共定位情况。2、缺血后Cx43的自噬降解是通过OPTN和NDP52两个自噬受体实现的:体外实验使用siRNA敲低OPTN或NDP52在原代小鼠星形胶质细胞的表达,设置对照组、敲低组、OGD组和敲低+OGD组,通过Western blotting检测缺血前后Cx43以及磷酸化Cx43(S368)的表达;设置对照组和OGD组,通过IF研究OGD前后小鼠星形胶质细胞中Cx43与自噬受体OPTN以及NDP52的共定位情况,并应用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)研究小鼠星形胶质细胞中缺血前后Cx43与自噬受体OPTN以及NDP52的连接情况;应用质粒过表达技术,在HeLa细胞系中过表达RFP-OPTN或RFP-NDP52,设置正常过表达组和OGD+过表达组,应用Co-IP研究HeLa细胞中缺血前后Cx43与自噬受体RFP-OPTN以及RFP-NDP52的连接情况,同时通过IF观察HeLa细胞中缺血前后Cx43与自噬受体RFP-OPTN以及RFP-NDP52的共定位情况;体内实验设置假手术组和MCAO组,通过IF研究MCAO前后小鼠脑冰冻切片中Cx43与自噬受体OPTN以及NDP52的共定位情况。3、缺血条件下Cx43的自噬降解与PINK1相关,且PINK1是上游蛋白:研究应用siRNA技术敲低PINK1在原代小鼠星形胶质细胞的表达,设置对照组、敲低组、OGD组和敲低+OGD组,通过Western blotting检测缺血前后Cx43以及磷酸化Cx43(S368)的表达;设置对照组、敲低组、OGD组和敲低+OGD组,应用Co-IP研究小鼠星形胶质细胞中缺血前后Cx43与OPTN、NDP52以及PINK1的连接情况;应用质粒过表达技术,在HeLa细胞系中同时过表达RFP-OPTN和PINK1-Myc或RFP-NDP52和PINK1-Myc,通过IF观察HeLa细胞中缺血前后Cx43、RFP-OPTN或RFP-NDP52和PINK1-Myc的共定位情况。4、缺血后Cx43的自噬降解与泛素化有关:应用质粒过表达,在HeLa细胞中过表达HA-Ub,设置过表达组和过表达+OGD组,通过Co-IP研究缺血前后HeLa细胞中的Cx43以及磷酸化Cx43(S368)和HA-Ub的连接情况。5、缺血后Cx43的磷酸化是其自噬降解的起点:应用氨基酸点突变技术构建GFP-Cx43,GFP-Cx43(368A)和GFP-Cx43(247A+265A)质粒,并在HeLa细胞中过表达,通过Co-IP研究缺血前后GFP-Cx43、GFP-Cx43(368A)和GFP-Cx43(247A+265A)和OPTN、NDP52以及PINK1的连接情况。6、干预Cx43自噬降解对神经免疫和细胞凋亡的影响:应用siRNA技术分别敲低Atg5、OPTN、NDP52和PINK1在小鼠星形胶质细胞的表达,设置分组为敲低组和相应敲低+OGD组,收集各组缺血前后的上清,应用流式细胞术测定上清TNF和IL-10的表达;应用siRNA敲低Cx43在小鼠星形胶质细胞的表达,设置分组为对照组、自噬激动剂组、OGD组、OGD+自噬激动剂组以及敲低Cx43后的以上四组(共八组),应用流式细胞术测定各组小鼠星形胶质细胞的凋亡比率。结果:1、Western blotting表明在缺血条件下,星形胶质细胞中Cx43的含量随缺血时间逐渐降低,磷酸化Cx43(S368)的含量同样下降;IF证明在缺血条件下,小鼠星形胶质细胞和小鼠脑冰冻切片中的Cx43与LC3b的共定位程度增加;Atg5敲低的小鼠星形胶质细胞中Cx43和磷酸化Cx43(S368)在缺血后出现了蓄积。2、在OPTN和NDP52分别敲低的小鼠星形胶质细胞中,Cx43和磷酸化Cx43(S368)在缺血后出现了蓄积;IF证明在缺血条件下,小鼠星形胶质细胞和小鼠脑冰冻切片中的Cx43与OPTN以及NDP52的共定位程度增加,HeLa细胞中的Cx43与RFP-OPTN以及RFP-NDP52的共定位增加;Co-IP证明在缺血条件下,小鼠星形胶质细胞中的Cx43与OPTN以及NDP52的连接增加,HeLa细胞中的Cx43与RFP-OPTN以及RFP-NDP52的连接增加。3、在PINK1敲低的小鼠星形胶质细胞中,Cx43和磷酸化Cx43(S368)在缺血后出现了蓄积;在PINK1敲低后的小鼠星形胶质细胞中,Cx43在缺血后与OPTN以及NDP52的连接发生了解偶联;Co-IP证明HeLa细胞中缺血后Cx43、RFP-OPTN或RFP-NDP52和PINK1-Myc的共定位增加。4、Co-IP证明在缺血条件下,转染泛素蛋白的Hela细胞的中Cx43以及磷酸化Cx43(S368)的泛素修饰水平升高,磷酸化的泛素S65修饰也同样升高。5、应用氨基酸点突变技术将Cx43的S368,Y265以及Y247位点突变后证明缺血后,Cx43与OPTN,NDP52以及PINK1的连接降低。6、流式细胞术证明在缺血时,阻碍Cx43的自噬降解会减少神经炎症的产生(TNF下降,IL-10上升),加速Cx43的降解或Cx43的敲低会减少星形胶质细胞的凋亡比率。结论:脑缺血条件下Cx43经自噬途径降解。缺血发生时,Cx43的S368、Y265及Y247位点被磷酸化,与此同时泛素分子的S65位点被PINK1磷酸化,磷酸化后的Cx43与磷酸化后的泛素分子结合从而被泛素化。携带磷酸化与泛素化修饰的Cx43与自噬受体OPTN和NDP52结合,靶向引入自噬体中降解。通过干预Cx43自噬降解通路证实Cx43在缺血中可能有潜在的促进凋亡和抑制炎症的作用,从而为脑缺血治疗提供新的治疗思路。