自发性高血压大鼠来源的血管平滑肌细胞易于衰老和钙化及其机制研究

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目的:研究纤维连接蛋白(fibronectin,FN)及其受体α5整合素(α5-integrin)在自发性高血压大鼠(SHR)胸主动脉平滑肌细胞(VSMCs)体外培养过程的衰老、钙化中的作用,探讨高血压大鼠来源的血管平滑肌细胞的体外衰老、钙化机制。方法:12周龄的SHR和WKY大鼠VSMCs体外培养,第三代用于实验中。按是否应用外源性FN包被、整合素受体阻断剂GRGDSP进行如下分组:SHR-FN组(S-F组)、SHR-GRGDSP组(S-G组)为实验组,而SHR组(S组)和WKY组(W组)为对照组。分别应用细胞衰老β半乳糖苷酶染色、von kossa染色、免疫细胞化学染色研究培养3d、6d、9d、12d VSMCs衰老、钙化的动态变化和FN、EDA-FN、α5-integrin的动态表达变化。应用Western blot比较W组和S组3d、6d、9d和12d VSMCs、各组培养12d时VSMCs和S组VSMCs经不同浓度FN包被培养12d的ALP的表达水平以评估VSMCs的表型转化。结果:(1)VSMCs衰老:各组VSMCs衰老程度随着培养时间的延长而增加(3d<6d<9d<12d)。3d时,S组和W组无明显差别(P>0.05),6d、9d、12d时,S组大于W组(P<0.05);同一时间点,S-F组大于S组(P<0.05);S-G组小于S组(P<0.05)。(2)VSMCs钙化:各组VSMCs钙化水平随培养时间的延长而增加(3d<6d<9d<12d);3d时,S组和W组无明显差别(P>0.05),6d、9d、12d时,S组大于W组(P<0.05);同一时间点,S-F组大于S组(P<0.05);S-G组小于S组(P<0.05)。(3)VSMCs的FN、EDA-FN、α5-integrin表达变化:三种蛋白在各组VSMCs表达随培养时间延长而上调(3d<6d<9d<12d)。(1)FN、EDA-FN表达:3d时,S组和W组无明显差别(P>0.05),6d、9d、12d时,S组大于W组(P<0.05);同一时间点,S-F组大于S组(P<0.05);S-G组和S组无明显差别(P>0.05)。(2)α5-integrin表达:同一时间点,S组大于W组(P<0.05),S-F组大于S组(P<0.05);S-G组和S组无明显差别(P>0.05)。(4)ALP表达变化:(1)W组和S组:随着培养时间延长,ALP表达逐渐上调,S组在3d时与W组无明显差别(P>0.05),而6d、9d、12d分别高于W组(P<0.05)。(2)12d时:S组高于W组(P<0.05);S-F组高于S组(P<0.05);S-G组低于S组(P<0.05)。(3)不同浓度外源性FN(5ug/cm2、10ug/cm2、15ug/cm2)包被S组的VSMCs12d后,随FN浓度增加,ALP表达上调(P<0.05)。结论:SHR比WKY大鼠来源的VSMCs在体外更易于衰老和钙化,其机制可能为高血压时VSMCs的FN及其亚型EDA-FN、α5-integrin表达上调,增加FN和整合素受体的结合,而诱导VSMCs向成骨细胞表型转化。
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