本试验以冬枣组培苗叶片、嫩茎和冬枣黄蕾期的花药为材料研究了各材料诱导愈伤组织的条件并以冬枣组培苗叶片、酸枣四倍体组培苗叶片和冬枣花药愈伤组织细胞悬浮系为材料,找出了适合各材料分离原生质体的纤维素酶和离析酶的浓度、甘露醇浓度、分离时间、离心速度。 1.冬枣组培苗叶片不适合用于诱导愈伤组织。适合冬枣组培苗嫩茎诱导愈伤组织的培养基为:1/2MS+ZT3.0mg/L+NAA10.0mg/L或1/2MS+ZT0.5mg/L+NAA2.0mg/L,愈伤组织状态理想。适合冬枣花药愈伤组织诱导的培养基为1/2MS+TDZ0.4mg/L+PVP2.0mg/L。 2.冬枣花药愈组织细胞悬浮系的增殖培养基为1/2MS+TDZ0.4,并且在继代后7～9天进行原生质体的分离。时间太短愈伤增殖速度慢,形成的新生愈伤组织少;超过10天,愈伤组织的颜色逐渐变褐,生命力降低,不适合分离原生质体。 3.冬枣花药愈伤组织的继代培养基为1/2MS+TDZ0.4mg/L,愈伤组织生长速度快,增殖量大,并能够在继代两年后仍保持旺盛的再生能力。 4.冬枣组培苗叶片、花药愈伤组织细胞悬浮系都是分离原生质体的良好材料,适宜冬枣组培苗叶片分离原生质体的酶液组成为0.7mol/L甘露醇+1%MES+5g/L纤维素酶。 5.适合四倍体酸枣组培苗叶片分离原生质体的酶液组成为0.6mol/L甘露醇+1%MES+10g/L纤维素酶+4～5g/L离析酶。 6.适宜花药愈伤组织细胞悬浮系分离原生质体的酶液组成为0.6mol/L甘露醇+1%MES+25g/L纤维素酶。 7.纯化原生质体时合适的离心速度为1010r/min,时间16min;梯度离心时的转速以870r/min为宜,7～8min。速度过高或过低都会影响原生质体的产量和活力。 8.适宜枣原生质体分离的时间为16～20h,时间太短酶液作用不充分,时间太长原生质体会发生破裂死亡。