芽孢杆菌（Bacillus spp.）是存在于土壤和植物微生态系统中的优势微生物种群,具有很强的抗逆能力和抑菌防病作用,其抗菌防病机制主要包括竞争作用、拮抗作用和诱导植物抗病性等方面。其中芽孢杆菌产生的细胞壁降解酶类（如蛋白酶、几丁质酶、β-1.3-葡聚糖酶等）是重要的拮抗物质之一。有关该菌产生的几丁质酶（Chitinase）和β-1.3-葡聚糖酶（β-1.3-glucanase）在生防中的作用已有一些研究。在工业上,芽孢杆菌是生产蛋白酶的主要菌株,国内有关芽孢杆菌产蛋白酶的报道很多,而未见显示明显生防活性的芽孢杆菌胞外蛋白酶及其拮抗作用的相关报道。本文从作物根际土壤中筛选高产蛋白酶并对棉花枯萎病菌及多种植物病原真菌具有拮抗作用的生防芽孢杆菌,并对其产生的胞外蛋白酶在生防中的作用进行了研究,具体结果如下:1.从山东泰安、青岛小麦和花生根际土壤中分离到的118株细菌中通过透明圈实验、平板抑菌实验得到1株高产蛋白酶并且对棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum）及多种植物病原真菌具有拮抗作用的生防细菌T2。通过形态特征、生理生化及16S rDNA同源性序列分析,鉴定该菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。2.明胶原位电泳结果显示:菌株T2在基础发酵培养基中诱导培养可产生多种蛋白酶。最佳产酶条件为37℃、60 h。培养液经硫酸铵分级沉淀（30%～50%）、DEAE Sepharose Fast Flow、SP Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75分子筛层析分离纯化到一种蛋白酶。经SDS-PAGE电泳银染后呈单带,分子量约为29.0 kDa。3.以酪蛋白为底物测定了温度和pH对蛋白酶活性的影响。结果表明:酶作用的最适温度为60℃,最适pH为8.0。在热稳定性方面,低于50℃时酶活性较稳定,50℃保温30 min,酶活性保持在80%以上。在pH稳定性方面,以不同pH值4℃处理1 h显示,该蛋白酶在pH5.0～7.5范围内较稳定。为进一步鉴定蛋白酶的性质,本研究测定了酶的底物特异性和金属离子及修饰剂对酶活性的影响。结果表明:该蛋白酶对酪蛋白具有最高的活性,对偶氮酪蛋白具有较高的活性,但对于牛血清白蛋白和卵清蛋白则活性较低。Na⁺、K⁺、Pb²⁺、EDTA对酶有激活作用,Ca²⁺、Ba²⁺、Al³⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Hg²⁺、SDS对酶有部分抑制作用,而PMSF可完全抑制酶活,因为PMSF是蛋白酶丝氨酸残基的特异性抑制剂,推测该酶是一种丝氨酸蛋白酶。4.菌株T2蛋白粗提液抑菌实验表明:经硫酸铵沉淀后的蛋白粗提液Ⅰ及加热（100℃,30 min）后的蛋白粗提液Ⅱ均可抑制棉花枯萎病菌菌丝生长及孢子萌发,但后者的抑制作用减弱,表明在参与拮抗作用的胞外蛋白中,除了耐热的抗菌蛋白类物质,不耐热的酶类等物质发挥了重要作用。进一步研究纯蛋白酶液对棉花枯萎病的拮抗作用发现,菌株T2所产生的胞外蛋白酶可使棉花枯萎病菌孢子萌发的芽管畸形、膨大、形成圆泡状物,使棉花枯萎菌菌丝溶解并发生明显变形。证明枯草芽孢杆菌T2产生的胞外蛋白酶在拮抗病原真菌过程中起到重要作用。