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背景和目的慢性乙型病毒性肝炎是一种严重危害人类健康的常见病,全球目前约有3.5亿慢性乙型肝炎病毒感染者；慢性丙型病毒性肝炎亦影响着全球近1.8亿人,该病的危险性主要在于其高慢性化率和可能发生的严重并发症,包括肝硬化和肝癌。病毒性肝炎的防治是一个全球性公共卫生问题,已引起世界各国的关注。干扰素(interferon, IFN)是目前公认的有效抗病毒药物,迄今在临床上已经使用了20多年。然而,作为一个小分子蛋白,干扰素从血浆中清除的速度较快,其清除相半衰期为注射后的3～8h,24h后在血浆中就已检测不到其存在,导致在临床治疗中需要重复多次给药才能达到治疗效果,造成临床应用中的一些不利。因此延长IFNa的半衰期,降低其副作用对IFNa的临床应用具有重要意义。目前延长干扰素半衰期的方法主要有聚乙二醇(PEG)修饰法、融合蛋白法。近年来,人们关注抗体IgG Fc段与干扰素融合蛋白(IFN/Fc)的生物学活性和药理作用。这两种干扰素融合蛋白的研制受到国内外学者的广泛关注,作为一种新的基因工程药物在表达系统建立和蛋白质纯化等方面进行了前沿性研究。本课题基于近几年蛋白质表达系统的研究进展,通过分子克隆技术和蛋白质工程技术,依据IgG Fc及IFN的特点,利用Bac-to-Bac杆状病毒昆虫表达系统,表达长效IFN/Fc融合蛋白,探索其基本生物学活性,期望提高干扰素的抗病毒治疗效果,为长效干扰素的抗病毒治疗探索新方法。方法1.利用分子克隆技术获得人IFNa2b及IgG4Fc基因片段,构建杆状病毒穿梭载体pFastBacl-IFN/Fc2.转化DH10Bac感受态菌株,获得重组杆粒Bacmid-IFN/Fc3.运用脂质体转染技术,将重组杆粒Bacmid-IFN/Fc转染至昆虫细胞High five,获得重组杆状病毒4.采用Western-Blot和ELISA检测目的蛋白的表达5.运用细胞病变抑制法测定融合蛋白体外抗病毒活性结果1.经PCR扩增、限制性内切酶酶切及核苷酸序列测定,证实获得IFNa2b及IgG4Fc基因片段,且正确克隆至杆状病毒穿梭载体pFastBacl中2.在DH10Bac菌株中筛选出含目的基因的重组杆粒3.重组杆粒转染High Five细胞后出现病理变化,表明转染成功并获得重组杆状病毒4. ELISA证实兔抗人IFNa抗体能够识别重组IFN/Fc融合蛋白5. Western-Blot鉴定IFN/Fc融合蛋白显示,在45kD处有特异性的蛋白条带6.用细胞病变抑制法测定IFN/Fc融合蛋白生物学活性为580IU/ml结论利用杆状病毒昆虫系统成功地表达重组人IFN/Fc融合蛋白,为新型长效干扰素研制及慢性病毒性肝炎治疗提供实验依据。