目前,耐药菌已成为严重威胁人们健康和生命的严重临床问题,抗菌肽（AMPs）被认为是常规抗生素对抗耐药菌威胁的潜在替代物。自然界中大多数阳离子抗菌肽不含组氨酸,只有部分含有组氨酸,而组氨酸的侧链咪唑基团往往使得这些抗菌肽具有与含其它阳离子氨基酸不同的性质,如易受金属离子的影响等。然而,组氨酸对阳离子抗菌肽结构、功能的影响还不是很清楚。因此,本研究拟以两种天然阳离子抗菌肽Polybia-MPI（MPI）和Protonectin（Pro）为研究对象,探究将组氨酸引入天然的、不含组氨酸的阳离子抗菌肽中而对抗菌肽的活性、构效关系、稳定性、毒性及肽对金属离子的响应等的影响。MPI和Pro分别是从社会性黄蜂Polybia paulista、Agelaia pallipes pallipes的毒液中分离出来的阳离子抗菌肽,具有较好的抗细菌、抗真菌活性和较低的细胞毒性,其中MPI序列中含三个赖氨酸,Pro的序列中含有一个赖氨酸。首先我们探讨了用组氨酸全部替换赖氨酸对MPI的抗菌活性、稳定性、二级结构、细胞毒性和细胞选择性的影响。研究发现,与MPI相比,His-Polybia-MPI（HMPI）只表现与MPI相当的抗真菌活性,而对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌则不表现活性;HMPI对胰蛋白酶的敏感性大大降低了,相比较于MPI其对胰蛋白酶更稳定;HMPI对小鼠成纤维细胞NIH 3T3的细胞毒性有显著性降低。二级结构研究结果显示,组氨酸替换后抗菌肽在膜模拟环境中呈现出典型的α-螺旋结构,但α-螺旋含量相比MPI有所下降。检测MPI和HMPI与LPS结合力发现,HMPI与LPS结合力要大大低于MPI与LPS结合力,它们与LPS的结合的解离常数（Kd）分别是3.22μM和21.5μM,这可能能部分解释HMPI对细菌抗菌活性大大降低。此外,我们研究还发现,HMPI诱导真菌细胞产生活性氧的活性与MPI相当,这可能是其与MPI能保持相当抗真菌活性的原因之一。值得注意的是,组氨酸的引入使得HMPI的等电点降低了,而使HMPI在中性偏碱环境中不表现阳离子性,这可能是造成其在中性环境中活性下降或丧失的主要原因。然后,我们探究了HMPI是否能与金属离子相互作用,以及金属离子会对HMPI的生物活性产生怎样的影响。体外抗真菌活性研究显示Cu²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Ag⁺、Cd²⁺及Pb²⁺对HMPI的抗真菌活性没有影响。但有趣的是,OD值检测酶解稳定性实验、菌落计数实验及RP-HPLC分析显示,铜离子可显著提高HMPI对胰蛋白酶的稳定性。造成HMPI-Cu²⁺复合物酶解稳定性提高的原因可能是由于HMPI与Cu²⁺的结合影响胰蛋白酶与HMPI的相互作用。CD实验结果显示在没有Cu²⁺的情况下,HMPI在水中呈无序构象,而在CuCl₂和CuSO₄的存在下,HMPI的CD谱在208和222nm处都是负峰,呈α-螺旋构象。进一步,我们通过ESI-MS、¹H NMR和ITC实验研究了Cu²⁺与HMPI的结合情况,证实了Cu²⁺可以与HMPI结合。溶血实验和细胞毒性实验显示,Cu²⁺可以降低HMPI的溶血毒性,不仅不会影响HMPI对哺乳动物细胞的细胞毒性,甚至还可以降低HMPI的细胞毒性。此外,活性氧实验表明Cu²⁺可以促进HMPI在白色念珠菌细胞中产生ROS,这可能有助于提高其抗真菌活性。我们的研究还发现,金属离子对序列中含有不同数量组氨酸的阳离子抗菌肽的影响是不一样的。与HMPI相比,仅含有一个组氨酸的抗菌肽His-Protonectin（HPro）虽不受Cu²⁺的影响,但是Zn²⁺却影响其活性。体外抗菌实验表明,Zn²⁺可以抑制HPro的抗真菌活性,使其抗光滑念珠菌的活性下降8倍以上,而Cu²⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺则对其抗真菌活性没有影响。PI摄取实验表明,在Zn²⁺存在的情况下,HPro不能破坏真菌细胞膜的完整性。同样,体内抗真菌实验显示Zn²⁺在小鼠体内对HPro的杀真菌活性同样具有显著的抑制作用。溶血实验表明,Zn²⁺的加入显著提高了HPro的溶血毒性。活性氧实验表明,Zn²⁺可以显著降低HPro诱导真菌产生活性氧的量,这可能与HPro+Zn²⁺抗真菌活性的降低相关。真菌代表性多糖结合实验表明,随着β-1,3葡聚糖浓度的增加,HPro的抗真菌活性逐渐下降,而HPro+Zn²⁺的抗真菌活性逐渐恢复。然而,¹H NMR谱却不能证实Zn²⁺与HPro的结合。Zn²⁺是如何影响HPro的活性还有待进一步研究。综上所述,本研究通过组氨酸替换对抗菌肽进行改造,降低了抗菌肽HMPI的等电点,使其在中性偏碱环境中不表现阳离子性,可以通过改变pH值来调节HMPI的抗菌活性。与此同时,组氨酸还可以降低抗菌肽HMPI的细胞毒性并提高其酶解稳定性。在此基础上,我们的研究还发现引入组氨酸后,在所测试的金属离子中,虽然抗菌肽HMPI的抗真菌活性不受Cu²⁺的影响,但Cu²⁺的结合可以增加其对胰蛋白酶的稳定性、降低其溶血毒性。然而,与HMPI不同的是,含单个组氨酸的阳离子抗菌肽HPro不受Cu²⁺影响,却受Zn²⁺的影响,且这种影响也与Cu²⁺对HMPI的影响不同。Zn²⁺的存在可以降低HPro的抗真菌活性,增加其溶血毒性。因此,可以推断组氨酸的引入对不同序列的抗菌肽的抗微生物活性、毒性及肽对金属离子的响应等影响都不同。尽管组氨酸对阳离子抗菌肽的影响还需进一步研究,但本研究可以为探究组氨酸在多肽修饰中的重要作用提供一定的研究基础。