防治马腺疫中药组方筛选及药效学评价研究

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马腺疫是由马链球菌马亚种(Streptococcus equi subspecies equi,S.equi)引起的一种细菌性疫病,具有高度传染性、急性接触性的特点,表现发热、精神抑郁、下颌咽下淋巴结肿胀,严重时会出现呼吸窘迫等典型临床症状。目前马腺疫主要通过抗生素和疫苗进行防治,但随着耐药菌株、变异菌株的出现,防治效果并不理想。中兽药具有毒副作用小、广谱等特点,为防治马腺疫提供了新思路。因此本研究拟创制出一种可防治马腺疫的中药组方,同时结合体内外试验验证其药效学作用,并初步探寻该组方对马腺疫致病菌-马链球菌马亚种的抑菌机制。本研究根据相关文献及书籍记载,选取其中出现频率高且药效强劲的27味单药,针对实验室保存的S.equi新疆株,通过体外抑菌试验(牛津杯法、最小抑菌浓度、最小杀菌浓度、联合药敏实验),结合L8(2~6)正交试验初步筛选抗S.equi中药组方的最佳优选因素。再通过L18(3~6)正交试验,优化得到基础组方的最佳配比。最后依据中兽医理论,向基础组方中增添两味补益药,通过体内保护率试验得到加味组方的最佳配比并联合组织脏器病理变化,验证加味组方各组的体内抑菌效果。结果显示,S.equi对7味中药敏感,其中浙贝母与雪白睡莲联合药敏指数>2,二者拮抗,故删除浙贝母。基础组方的最佳配比是赤芍:甘草:大黄:雪白睡莲:山豆根:苦参=4:2:2:4:4:1;由加味试验结果可知,在黄芪:当归=1:1配伍浓度为500 mg/m L时加味,最优组方的保护率可达87.5%,且加味各组组方对S.equi所致的小鼠肺脏炎性损伤修复良好,将最终优选加味组方命名为组方1。基于对新药开发的要求,本研究通过急性毒性试验、体外抑菌试验(牛津杯法、最小抑菌浓度、最小杀菌浓度)和马腺疫小鼠模型体内治疗试验,验证复方临床用药的安全性及有效性。急性毒性试验显示组方1毒性极低,最大耐受量为480 g/kg,可保证临床正常用药安全;S.equi在体外对组方1高度敏感,抑菌圈直径可达15.56 mm,最小抑菌浓度为0.3125 g/m L,最小杀菌浓度为0.1563 g/m L;体内治疗结果可见,组方1对马腺疫小鼠动物模型的保护率为75%,可有效降低S.equi对小鼠的侵袭力。最后,测评了组方1对S.equi的生长情况(细胞膜与细胞壁完整性、通透性,细菌形态变化)和毒力因子表达(透明质酸酶、溶血素S活力、FNEB锚定蛋白表达量)的影响,初步探究组方1抑制S.equi的作用机制。由结果可知,组方1可通过破坏S.equi细胞壁完整性、增大细胞膜通透性等对S.equi生长产生抑制,同时组方1可以有效抑制透明质酸酶、溶血素S活力,显著降低FNEB锚定蛋白的表达量。综上所述,本研究成功研制出一种可以有效抑制S.equi的中药组方,可为临床治疗马腺疫提供一定的技术支持。
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