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目的腹泻型肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome-Diarrhea,IBS-D)是一种慢性功能性肠病,属中医泄泻、郁证等病症范畴,主要症状表现为反复发作的腹胀、腹痛、腹泻,其诱发因素包括社会环境、心理、肠道、遗传等,中医认为肝郁脾虚泄泻是其主要病机,最常见的证型是肝郁脾虚型,患者多伴有焦虑抑郁等精神异常状态,临床上也常见抗抑郁药辅助治疗IBS-D。疏肝健脾代表方——肠激安方为治疗IBS-D的临床验方,从肝脾论治,同时改善肠道症状及调畅情志,疗效确切。课题组前期采用母婴分离+醋酸刺激+束缚应激三因素结合的方法成功建立了肝郁脾虚型IBS-D大鼠模型,肠激安方可改善其内脏高敏感性、腹泻症状,调控肥大细胞颗粒、CD4+/CD8+、5-HT、NPY、GABA等神经-内分泌-免疫系统相关因子。BDNF在多种精神疾病如焦虑、抑郁中有重要作用,有研究报道IBS-D患者结肠黏膜活检标本中BDNF高表达,与腹痛严重程度有良好的相关性;也有研究报道BDNF可通过JAK/STAT通路调控GABAARα1,但BDNF及相关因子在IBS-D中的作用机制尚不明确。因此,本论文针对肠激安方对肝郁脾虚型IBS-D大鼠神经系统的作用,拟通过动物实验和细胞实验的相互验证,进一步探讨疏肝健脾方对肝郁脾虚型IBS-D大鼠的作用机制。动物实验方面:(1)探讨肝郁脾虚IBS-D大鼠焦虑-抑郁样行为、海马CA1、CA3、DG区神经元的变化,以及肠激安方的作用,(2)观察肠激安方对IBS-D大鼠血清、海马、结肠组织中BDNF蛋白与mRNA表达的影响,(3)观察肠激安方对IBS-D大鼠海马GABAARα1、GABAARα2、TrkB、CREBmRNA表达的影响,(4)观察肠激安方对IBS-D大鼠海马JAK2/STAT3信号通路的调控作用,探讨肠激安方通过BDNF/JAK2/STAT3/GABAAR通路改善肝郁脾虚型IBS-D大鼠症状的作用机制。细胞实验方面:(1)筛选皮质酮诱导损伤PC12细胞的条件,(2)探讨肠激安方对皮质酮诱导损伤的PC12细胞模型中BDNF/JAK2/STAT3/GABAAR通路的干预作用。方法一、疏肝健脾方对肝郁脾虚型IBS-D大鼠BDNF/JAK2/STAT3/GABAAR通路的调控作用(1)采用母婴分离+醋酸刺激+束缚应激三因素结合的方法制备肝郁脾虚型IBS-D大鼠模型;造模成功后将大鼠随机分为模型对照组、匹维溴铵组(0.018 g kg-1)、肠激安方高剂量组(33.48 g.kg-1)、肠激安方低剂量组(16.74 g·kg—1),另取同批次正常大鼠做为正常对照组,各6只,连续灌胃14d,正常组和模型组给予等体积生理盐水。给药结束后进行糖水偏好试验以及旷场试验检测IBS-D大鼠的焦虑-抑郁样行为,HE染色观察海马神经元形态变化。(2)造模给药后取各组大鼠血清、海马、结肠组织,ELISA法检测各组大鼠血清中BDNF的含量,Q-PCR、免疫组化、Western Blot法分别检测海马、结肠中BDNF的基因、蛋白表达(3)造模给药后取各组大鼠海马组织,Q-PCR检测海马中GABAARα1、GABAARα2、TrkB、CREBmRNA 表达。(4)造模给药后取各组大鼠海马组织,Q-PCR检测海马中JAK2、STAT3、TNF-α、IL6的基因表达,免疫组化检测STAT3蛋白原位表达,Western Blot法分别检测JAK2、STAT3、pSTAT3 蛋白表达。二、疏肝健脾方对皮质酮诱导损伤PC12细胞模型BDNF/JAK2/STAT3/GABAAR通路的调控作用(1)培养PC12细胞,采用CCK8法检测不同接种密度、培养时间以及皮质酮浓度对PC12细胞增殖的影响,并结合显微镜观察细胞的生长形态。(2)CCK8法筛选出肠激安方干预PC12细胞的合适浓度,分为高(5.0mg/ml)、中(2.5mg/ml)、低剂量(1.25mg/ml)组进行干预皮质酮(200μM)诱导损伤的PC12细胞模型,采用流式细胞仪检测细胞内游离Ca2+浓度,酶标仪检测细胞分泌NO浓度,Q-PCR 法考察 BDNF、JAK2、STAT3、TrkB、CREB、GABAARα1、GABAARα2 的基因表达;Western Blot法分别检测BDNF、JAK2、STAT3、pSTAT3蛋白表达。结果一、疏肝健脾方对肝郁脾虚型IBS-D大鼠BDNF/JAK2/STAT3/GABAAR通路的调控作用(1)和正常对照组相比,模型对照组糖水偏好值明显降低(P<0.05),旷场实验水平运动、垂直运动得分以及中央格停留时间明显减少(P<0.05),肠激安方高剂量、低剂量组的糖水偏好值、旷场实验水平运动、垂直运动得分以及中央格停留时间均明显升高(P<0.05),匹维溴铵组糖水偏好值、旷场实验水平运动、垂直运动得分以及中央格停留时间呈上升趋势,但只有垂直运动得分有统计学差异(P<0.05)。正常对照组大鼠海马CA1区细胞层次结构清晰,排列整齐紧密,大小一致,细胞结构清晰,胞核圆形或椭圆形,模型对照组大鼠海马CA1细胞层次稍紊乱,排列不甚规则,各给药组有所改善。各组大鼠海马CA3区、DG区细胞形态无明显差异,细胞排列整齐紧密,层次清晰,细胞呈圆形或椭圆形,核仁清晰可见,染色质分布均匀。(2)与正常对照组比较,IBS-D模型大鼠血清中BDNF含量明显减少(P<0.05),给予药物治疗后,各给药组大鼠血清BDNF含量与模型对照组比较明显升高(P<0.05),与正常对照组比较无明显差异(P>0.05)。与正常对照组比较,IBS-D模型大鼠海马、结肠组织中BDNFmRNA表达明显升高(P<0.05),给予药物治疗后,各给药组大鼠海马、结肠组织中BDNF mRNA的表达与模型对照组比较明显下降(P<0.05)。与正常对照组比较,IBS-D模型大鼠海马、结肠组织中BDNF蛋白表达明显增加(P<0.05),给予药物治疗后,肠激安高、低剂量组大鼠海马、结肠组织中BDNF蛋白表达与模型对照组比较明显减少(P<0.05),匹维溴铵组大鼠结肠组织中BDNF蛋白表达与模型对照组比较显著减少(P<0.05),而海马中BDNF蛋白表达含量减少,但无统计学差异(P>0.05)。(3)和正常组相比,IBS-D模型大鼠海马中GABAARα1、GABAARα2、CREB mRNA表达减少(P<0.05),TrkBmRNA表达明显增加(P<0.05);给予药物治疗后,肠激安方高剂量组GABAARα1、GABAARα2、CREBmRNA相对表达量较模型组升高(P<0.05),TrkB mRNA相对表达量较模型组降低(P<0.05);肠激安方低剂量组CREB、TrkBmRNA相对表达量较模型组分别升高、降低(P<0.05),GABAARα1、GABAARα2mRNA相对表达量有升高趋势,但无统计学差异(P>0.05);而匹维溴铵组GABAARα1、GABAARα2、CREB mRNA相对表达量较模型组升高(P<0.05),TrkB mRNA相对表达量较模型组降低(P<0.05)。(4)与正常对照组比较,IBS-D模型大鼠海马中JAK2、STAT3、TNF-αmRNA表达明显增加(P<0.05),IL6虽有上升的趋势,但是无统计学差异(P>0.05);而给予药物治疗后,肠激安方高剂量组JAK2、STAT3、TNF-αmRNA相对表达量较模型组减少(P<0.05);肠激安方低剂量组STAT3、TNF-αmRNA相对表达量较模型组减少(P<0.05),JAK2mRNA有减少的趋势,但无统计学差异(P>0.05)。匹维溴铵组STAT3 mRNA相对表达量较模型组减少(P<0.05),TNF-α、JAK2 mRNA有减少的趋势,但无统计学差异(P>0.05)。与正常对照组比较,IBS-D模型大鼠海马JAK2、STAT3、pSTAT3蛋白表达明显增加(P<0.05);与模型对照组比较,肠激安方高剂量组大鼠海马JAK2、STAT3、pSTAT3蛋白表达减少(P<0.05),肠激安方低剂量组大鼠海马JAK2、STAT3蛋白表达减少(P<0.05),pSTAT3蛋白表达也减少但无统计学差异(P>0.05);匹维溴铵组大鼠海马中JAK2、STAT3、pSTAT3蛋白表达量也均相对减少,但无统计学差异(P>0.05)二、疏肝健脾方对皮质酮诱导损伤PC12细胞模型BDNF/JAK2/STAT3/GABAAR通路的调控作用(1)接种密度为1×105/ml的PC12细胞在72h内生长状态正常;4000μM的皮质酮对PC12细胞增殖的抑制率约61.61%(P<0.05),细胞大部分收缩漂浮;30μM、250μM的皮质酮对PC12细胞增殖的抑制率分别为48.58%、49.58%(P<0.05),有较多的细胞收缩漂浮;200μM的皮质酮对PC12细胞增殖的抑制率为36.41%(P<0.05),收缩漂浮的细胞较少,大部分细胞呈梭状,突触明显。100μM的皮质酮对PC12细胞增殖的抑制率为15.33%(P>0.05),大部分细胞呈梭状,突触明显,个别细胞收缩漂浮。(2)皮质酮诱导损伤PC12细胞后,细胞内游离Ca2+浓度以及NO分泌均明显增加(P<0.05),而肠激安方高、中、低剂量均能减少Cα2+浓度以及NO分泌(P<0.05)。模型组细胞 BDNF、TrkB、JAK2、STAT3mRNA 表达增加,GABAARα1、GABAARα2 mRNA表达减少,CREB mRNA无明显变化(P>0.05);与模型组比较,肠激安高剂量组 BDNF、TrkB、JAK2、STAT3 mRNA表达减少(P<0.05),GABAARα1、GABAARα2 mRNA表达增加(P<0.05),中剂量组TrkB、JAK2、STAT3 mRNA表达减少(P<0.05),GABAARα1、GABAARα2mRNA表达增加(P<0.05),低剂量组 TrkB、JAK2、STAT3mRNA表达减少(P<0.05),GABAARα1mRNA表达增加(P<0.05);与正常对照组比较,模型组BDNF、JAK2、STAT3、pSTAT3蛋白表达明显增加(P<0.05);与模型对照组比较,肠激安方高、中、低剂量组BDNF、JAK2、STAT3、pSTAT3蛋白表达均减少(P<0.05)。结论(1)"三因素"法制备的肝郁脾虚IBS-D大鼠有明显焦虑-抑郁样行为,但海马神经元无明显形态变化,肠激安方可明显改善IBS-D焦虑-抑郁样行为。BDNF在肝郁脾虚型IBS-D血清、海马、结肠均异常表达,而肠激安方可上调血清中BDNF的表达水平,下调结肠、海马中BDNF的表达水平;同时肠激安方还可上调肝郁脾虚型IBS-D大鼠海马中GABAARα1、GABAARα2、CREB mRNA表达水平,下调TrkB mRNA表达水平;在IBS-D大鼠海马中JAK2/STAT3通路被激活,肠激安方可抑制该信号通路的活性。下调海马中BDNF水平,抑制JAK2/STAT3通路活性,增加GABAARα1、GABAARα2的表达,这可能也是肠激安方对IBS-D的作用机制。(2)肠激安方可抑制皮质酮诱导损伤PC12细胞胞内Cα2+浓度升高及NO分泌增多,可下调皮质酮诱导损伤PC12细胞BDNF、TrkB表达水平,抑制JAK2/STAT3信号通路,上调GABAARα1、GABAARα2表达水平。综上,调控BDNF/JAK2/STAT3/GABAAR通路可能是疏肝健脾方改善"肝郁脾虚"IBS-D的作用机制之一。