伪狂犬病（Pseudorabies）又称Aujeszky氏病,是由疱疹病毒科（Herpesviridae）α亚科中的猪疱疹病毒Ⅰ型（suid herpes virus Ⅰ）所引起的猪、牛、羊等多种家畜及野生动物的一种以发热、奇痒（除猪外）、脑脊髓炎为主要症状的急性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类传染病。猪是该病的主要贮存宿主和传染源,对养猪业造成的经济损失仅次于猪瘟和口蹄疫。伪狂犬病病毒上海株（PRV SH）是从上海地区某猪场发病猪中分离的一株地方毒株,与强毒株Ea株具有相似的特性。经过对PRV SH株TK基因序列分析发现,PRV SH株TK基因与我国的地方分离株Ea株和Fa株的基因同源性及推导的氨基酸同源性都很高,所以选择PRV SH株为亲本毒株在我国具有一定的实用价值。 Cre/loxP位点特异性重组系统具有位点特异、时期特异、组织特异和高效重组的特点,可广泛用于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物的体内、体外基因重组。Cre和loxP均来自于P1噬菌体,其介导的基因重组不需要其他蛋白质或辅助因子参与,仅需纳摩尔的量即可与loxP位点结合,完成体内或体外的DNA的重组,将外源基因定点整合到染色体上或将特定的DNA片段删除;Cre/loxP重组系统在基因靶位操作、基因功能地鉴定、外源基因的整合等方面得到了有效的利用,在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面成为一个有力的工具。 根据GenBank已发表的pEGFP-C1序列,设计并合成两对引物,PCR扩增出两端各舍一同向loxP位点的GFP表达盒GFP-loxP。克隆于载体pSKLR获得转移载体pSKLR-GFP-loxP;提取转移载体质粒,经聚乙二醇纯化后,用磷酸钙转染法与PRY SH株共转染293T细胞,在5—溴脱氧尿嘧啶（BrdU）的筛选压力下,利用蚀斑法TK^-143细胞筛选出含绿色荧光的TK基因缺失的重组毒株,命名为rPRV₁;以此重组毒株为亲本毒,共转染表达Cre酶的质粒POG231,在Cre酶的作用下去除GFP表达盒以及一个loxP位点,以蚀斑法得到纯化的含单个loxP位点的重组病毒株,命名为rPRV₂。 本实验测定了重组病毒rPRV₁和rPRV₂在细胞上的生长特性、对老鼠的半数致死量。实验结果显示,缺失了TK基因后,其在细胞上的生长状况和病毒的滴度未见明显影响,且34bp的loxP位点在TK基因的插入对病毒的复制不产生明显影响。突变株对小鼠的半数致死量比亲本毒高至少220倍,表明突变株的毒力比亲本毒大大下降。