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目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病较为多见的并发症之一,它的主要特征是早期的肾脏体积增大和晚期的肾小球硬化。近年来,糖尿病肾病的全球发病率逐年递增,目前也是导致终末期肾病（end-stage renal disease,ESRD）的重要原因。系膜细胞（mesangial cells,MCs）作为肾脏固有细胞之一,具有调节肾小球滤过率、分泌多种生物活性物质等作用,它也是糖尿病肾病发病机制中的主要靶细胞。Sestrin2作为一种应激诱导蛋白,可被多种代谢应激条件激活,如缺氧、DNA损伤、氧化应激和内质网应激等。在本研究中我们以糖尿病肾病患者肾活检组织、糖尿病小鼠和体外培养人系膜细胞（human mesangial cells,HMCs）为研究对象,旨在探讨Sestrin2在糖尿病肾病系膜细胞增殖和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）合成中的作用,为更加明确糖尿病肾病的发病机制,寻找糖尿病肾病的治疗靶点提供新思路。方法:1.Sestrin2在糖尿病肾小球系膜细胞中的表达（1）以经过病理验证为非糖尿病肾脏肿瘤患者的肿瘤远端肾组织和糖尿病肾病患者肾组织活检标本为研究对象,免疫组织化学技术（immunohistochemistry,IHC）检测肾小球系膜区Sestrin2的表达。（2）以C57BL/6J为背景的12周龄的雄性Sesn2转基因（Sesn2transgenic,Sesn2 tg）和野生型（wild type,WT）小鼠为研究对象,留取24小时尿标本,处死小鼠留取血标本、保存肾组织。IHC检测小鼠肾小球中Sestrin2的表达,PAS观察小鼠肾小球形态学的改变。（3）以体外培养的HMCs为研究对象,高糖刺激0、6、12、24、48和72小时。Western blot和RT-PCR分别检测Sestrin2蛋白和m RNA的表达。将HMCs分为三组,分别为正常糖组（NG）、高渗组（M）和高糖组（HG）。细胞免疫荧光检测Sestrin2在HMC中的表达及定位。2.Sestrin2对高糖培养的HMCs增殖的影响以体外培养的HMCs为研究对象,将HMCs分为六组,分别为正常糖组（NG）、高渗组（M）、高糖组（HG）、高糖+空载质粒对照组（HG+C）、高糖+Sesn2过表达转染组（HG+Sesn2 OE）和高糖+Sesn2 sh RNA转染组（HG+Sesn2 sh RNA）。细胞数量至60%时分别转染空载质粒、Sesn2过表达、Sesn2敲除质粒,孵育6小时后,加入30 m M高糖刺激24小时后,裂解细胞收集并进行后续实验。RT-PCR检测PCNA m RNA的表达。WB检测PCNA蛋白的表达,免疫荧光检测PCNA和Ki67的定位。CCK8检测Sestrin2对高糖培养的系膜细胞活力的影响。3.Sestrin2对高糖培养的HMCs中ECM合成的影响以C57BL/6J为背景的12周龄的雄性Sesn2转基因（Sesn2 transgenic,Sesn2 tg）和野生型（wild type,WT）小鼠为研究对象,免疫荧光检测Fibronectin和CollagenⅣ的表达。细胞培养方法及分组同上。RT-PCR检测Fibronectin和CollagenⅣm RNA的表达情况。WB和免疫荧光检测Fibronectin和CollagenⅣ蛋白的表达及定位。酶联免疫吸附法ELISA（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测细胞培养上清中Fibronectin和CollagenⅣ的含量。4.Sestrin2对YAP-TEAD1的影响为进一步探讨Sestrin2与YAP-TEAD1的关系,细胞培养方法及分组同上。WB和免疫荧光检测p-YAP（Ser127）、YAP和TEAD1蛋白的表达及定位。免疫荧光双染检测YAP和TEAD1的表达。免疫共沉淀（Co-Imm unoprecipitation,Co-IP）检测YAP和TEAD1的关系。5.抑制YAP对高糖培养的HMCs中增殖、ECM合成的影响为研究YAP是否会影响HMCs的增殖和ECM合成,将HMCs随机分为正常糖组（NG）、高渗组（M）、高糖组（HG）、高糖加YAP抑制剂维替泊芬组（HG+Verteporfin,HG+VP）,孵育48 h后收集细胞。Western blot检测YAP、PCNA、Fibronectin和CollagenⅣ的表达。CCK8检测YAP抑制剂维替泊芬对高糖培养的系膜细胞活力的影响。结果:1.Sestrin2蛋白在糖尿病肾小球系膜细胞中的表达（1）IHC结果显示,与非糖尿病肾脏肿瘤患者的肿瘤远端肾组织相比,DN患者肾脏中肾小球系膜区中Sestrin2表达显著降低。（2）IHC结果显示,与野生型小鼠相比,野生型糖尿病小鼠Sestrin2的表达明显降低;与野生型糖尿病小鼠相比,Sesn2 tg糖尿病小鼠肾小球系膜区的表达水平增高。PAS染色显示,Sesn2 tg能够改善糖尿病小鼠的肾小球系膜扩张和肥大。（3）在HG培养的HMCs中,与HG刺激0小时相比,Sestrin2的表达水平随刺激时间增长而逐渐降低,在24小时表达水平最低,随后出现小幅度升高。2.Sestrin2对高糖培养的HMCs增殖中的影响实验结果显示,HG刺激后,PCNA、Ki67的表达增强。与空载质粒组相比,转染Sesn2过表达质粒后可显著降低HG状态下HMCs中PCNA、Ki67的表达,转染Sesn2 sh RNA组中PCNA、Ki67的表达升高。CCK-8实验结果显示,HG刺激后,细胞活力增强。与空载质粒组相比,转染Sesn2过表达质粒后可降低HG状态下的细胞活力,转染Sesn2 sh RNA组细胞活力明显增加。3.Sestrin2对高糖培养的HMCs中ECM合成的影响免疫荧光结果显示,与野生型小鼠相比,野生型糖尿病小鼠中Fibronectin和CollagenⅣ的表达明显升高;与野生型糖尿病小鼠相比,Sesn2 tg糖尿病小鼠中Fibronectin和CollagenⅣ的表达明显降低。WB结果显示,HG刺激后,Fibronectin和CollagenⅣ的表达增强。与空载质粒组相比,转染Sesn2过表达质粒后可显著降低HG状态下HMCs中Fibronectin和CollagenⅣ的表达,转染Sesn2 sh RNA组中Fibronectin和CollagenⅣ的表达均明显升高。4.Sestrin2对高糖诱导的HMCs在YAP-TEAD1信号通路中的影响WB结果显示,HG刺激后,YAP、TEAD1的表达增强,p-YAP（Ser127）的表达降低。与空载质粒组相比,转染Sesn2过表达质粒后可显著降低HG状态下HMCs中YAP、TEAD1的表达,明显升高HG状态下HMCs中p-YAP（Ser127）的表达。转染Sesn2 sh RNA组中YAP、TEAD1的表达明显上调,p-YAP（Ser127）的表达显著下调。免疫荧光结果与WB结果一致。免疫荧光双染结果显示,YAP与TEAD1在同一位置表达。Co-IP结果显示,YAP的沉淀物中YAP和TEAD1蛋白表达增强。5.抑制YAP对高糖培养的HMCs中增殖、ECM合成的影响WB结果显示,与HG组相比,加入YAP抑制剂后,YAP、PCNA、Fibronectin和CollagenⅣ的表达显著下调。CCK8实验结果显示,加入YAP抑制剂后,细胞活力明显下降。结论:在糖尿病肾病时Sestrin2表达下调,并通过激活YAP-TEAD1信号通路促进系膜细胞增殖和ECM的合成,从而参与肾小球硬化的发生和发展。