研究背景：随着人们生活水平的提高及生活方式的改变,2型糖尿病(type2diabetes mellitus, T2DM)的发病率在我国呈现出高速发展的趋势。据2009年流行病学数据显示,我国T2DM的发病率已达到9.7%,总患病人数9240万,跃居世界第一位。因此,探索糖尿病的发病机制一直是糖尿病领域研究的热点及重点。肠促胰岛素效应是机体调控餐后胰岛素分泌及餐后血糖的重要机制,该效应的发现使2型糖尿病在发病机制和治疗上取得了突破性的进展。胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)则是肠道L细胞分泌的一种重要的肠肽激素,可通过其受体葡萄糖依赖性的促进胰岛素的分泌,并能促进胰岛p细胞增殖和抑制其凋亡。诸多研究证实,2型糖尿病患者中肠促胰岛素效应明显受损,主要表现为内源性GLP-1的产生和分泌不足,而肠道L细胞的早期损伤或凋亡可能是GLP-1分泌减少的主要原因并参与了2型糖尿病的发生和发展。目前研究多集中在不同药物对肠道内源性GLP-1分泌的调节作用及L细胞分泌GLP-1的可能通路方面。很少有针对肠道L细胞早期损伤及凋亡方面开展的研究,特别是糖尿病糖基化终末产物(advanced glycation end-products, AGEs)对L细胞功能的可能影响方面未见研究报道,AGEs及其受体(RAGE)通路是导致糖尿病多种组织细胞损伤的重要机制,因此,探明AGEs-RAGE是否会导致肠道L细胞的损伤以及损伤的可能机制和信号通路对于深入理解和完善2型糖尿病的发病机制有着重要意义。糖基化终末产物(AGEs)是长期高血糖与多种蛋白质发生糖基化作用,形成的具有毒性而不可逆的化合物,大量的不可逆的AGEs的产生和积聚是细胞损伤及糖尿病慢性进展的重要机制。AGEs与其受体RAGE (Receptor for AGE)结合可以上调炎症反应并导致组织细胞的破坏,因此AGEs被认为是一类能激活细胞并能促进氧化应激反应的前炎症介质。诸多研究发现,AGEs-RAGE通路不仅介导了多种细胞的损伤,而且导致胰岛等内分泌细胞凋亡及功能损伤,而2013年最新的研究也得出类似的研究结果：高浓度的AGEs可以明显上调胰岛细胞表面RAGE受体的表达,AGEs与其受体RAGE结合后可激活NADPH氧化酶导致细胞内活性氧产生增加,促进炎症核转录因子NF-κB表达及上调Bax/Bcl-2比例,最终导致胰岛细胞凋亡率的明显增加,利用NADPH氧化酶的抑制剂可改善AGEs诱导的胰岛细胞凋亡。由此可见,AGEs-RAGE通路通过激活NADPH氧化酶导致细胞内ROS增加,进而促进炎症核转录因子NF-κB表达以及Bax/Bcl-2比例上调,这是导致胰岛细胞凋亡及胰岛素分泌减少的一个重要机制。有意思的是,本科室其他同事已完成的脂多糖(LPS)对肠道L细胞凋亡及分泌功能影响的实验研究,发现LPS体外可通过促进NF-κB的表达和释放以及下调抗凋亡基因Bcl-2水平诱导体外培养的L细胞发生凋亡,进而减少内源性GLP-1的分泌水平,这种损伤具有时间及剂量的依赖性,而LPS和AGEs均可通过RAGE受体及其下游通路介导细胞的损伤。这表明L细胞凋亡可能是体内GLP-1分泌减少的原因之一,而RAGE起着重要的作用。因此,本课题以L细胞株(GLUTag细胞)为研究对象,拟从以下几个方面进行初步探讨：1、观察AGEs对肠道L细胞株(GLUTag细胞)早期损伤、凋亡及GLP-1分泌水平的影响；2、探讨AGEs是否通过AGEs-RAGE通路对GLUTag细胞产生损伤、凋亡及其相关机制。为进一步阐明2型糖尿病体内GLP-1减少的原因以及探索新的2型糖尿病治疗方案提供新的线索。第一部分AGEs对L细胞株(GLUTag)早期损伤、凋亡及GLP-1分泌水平的影响目的：观察AGEs对肠道L细胞株GLUTag细胞早期损伤、凋亡及GLP-1分泌水平的影响。方法：(1)体外制备、鉴定糖基化终产物将胎牛血清白蛋白(BSA)和D-葡萄糖溶于PBS中,避光孵育12周制备AGE-BSA。以荧光分光光度计鉴定AGE-BSA。(2)传代培养GLUTag细胞用低糖DMEM培养基,加入10%的胎牛血清,100IM/ml青霉素和100IM/ml链霉素所配置的细胞完全培养基传代培养GLUTag细胞。(3)实验分组：不同浓度AGEs的影响：空白对照组,即不加入干预因素；BSA对照组；AGEs100μg/ml组; AGEs200μg/ml组；AGEs300μg/ml组,分别作用细胞24h。AGEs作用不同时间的影响：200μg/mL AGEs分别作用GLUTag细胞0、12、24、48h。(4) AGEs对GLUTag细胞凋亡的影响分组及培养条件同上,各组细胞干预结束后利用Hoechst33258荧光染色观察细胞形态学变化。Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡率。(5) AGEs对GLUTag细胞活性的影响分组及培养条件同上,各组均利用CCK-8法检测GLUTag细胞增殖活性。(6) AGEs对GLUTag细胞GLP-1分泌的影响分组及培养条件同上,收集细胞上清液,利用ELISA检测GLUTag细胞GLP-1分泌水平。统计学处理：采用SPSS13.0进行统计分析,实验数据计量资料以均数±标准差(i±s)表示,采用单向方差分析(One-Way ANOVA)检验,两两比较采用LSD法。凋亡率采用析因设计的方差分析。P<0.050具有统计学意义。结果：(1)不同浓度AGEs对GLUTag细胞形态学的影响各组经药物干预24h后,Hoechst33258染色后荧光显微镜下观察：空白对照组及BSA对照组GLUTag细胞的细胞核呈均匀荧光,为浅蓝色,且结构正常；AGEs100μg/ml组GLUTag细胞大部分细胞核均匀浅蓝色染色,偶见部分细胞核固缩,核染色致密呈亮蓝色或裂解呈颗粒状；AGEs200μg/ml组GLUTag细胞质固缩、偏移,核致密浓染,核呈颗粒状或碎片状,核染色质边集;AGEs300μg/ml组GLUTag细胞大片浓染,呈大面积亮蓝色,凋亡小体、核固缩及核碎裂的细胞较AGEs200μg/ml组明显增多。(2)比较AGEs不同作用时间对GLUTag细胞形态学的影响200μg/ml AGEs作用时间(0h)后的GLUTag细胞的细胞核呈均匀淡染；200μg/ml AGEs作用时间(12h)后的GLUTag细胞的细胞核大部分呈均匀浅染,偶见部分细胞核染色致密呈亮蓝色；200μg/ml AGEs作用时间(24h)后的GLUTag细胞的细胞质固缩,核致密浓染或裂解呈颗粒状,核染色质边集；200μg/ml AGEs作用时间(48h)后的GLUTag细胞的细胞核大面积浓染,细胞皱缩,核固缩、偏移及碎裂的细胞较作用时间为24h明显增多。(3)不同浓度AGEs处理24h对GLUTag细胞凋亡率的影响各组细胞经药物干预24h后,100μg/ml AGEs组的凋亡细胞百分率为(15.30±2.89)%,显著高于空白对照组(6.43±1.03)%和BSA对照组(7.37±1.50)%(P=0.000);200μg/ml AGEs组的凋亡细胞百分率为(24.10±2.95)%,显著高于空白对照组和BSA对照组(P=0.000),同时亦显著高于100μg/ml AGEs组(P=0.000);300μg/ml AGEs组的凋亡细胞百分率为(35.19±3.76)%,显著高于空白对照组、BSA对照组及100μg/ml AGEs组(P=0.000),同时亦显著高于200μg/ml AGEs组(P<0.05)。(4)比较AGEs不同作用时间对GLUTag细胞凋亡的影响200μg/ml AGEs作用时间(12h)后的凋亡细胞百分率为(12.61±1.94)%,显著高于阴性对照组(6.30±2.23)%(P=0.000)；200μg/ml AGEs作用时间(24h)后的凋亡细胞百分率为(21.77±3.41)%,显著高于阴性对照组及作用12h组(P=0.00);200μg/ml AGEs作用时间(48h)后的凋亡细胞百分率为(29.52±4.42)%,显著高于阴性对照组及作用12h组(P=0.000),同时亦显著高于作用24h组(P<0.05)。(5)不同浓度AGEs处理24h对GLUTag细胞活性的影响100、200.300μg/ml AGEs作用GLUTag细胞24h后,OD值分别为0.8±0.05,0.66±0.05,0.4±0.06,均显著低于空白对照组(control)(1.21±0.05)和BSA对照组(200μg/ml BSA)(1.19±0.03)(P=0.000)。而且,200μg/ml AGEs组显著低于100μg/ml AGEs组(P=0.000),300μg/ml AGEs组显著低于100μg/ml AGEs组(P=0.000)及200μg/ml AGEs组(P<0.05)。(6)比较AGEs不同作用时间对GLUTag细胞活性的影响200μg/ml AGEs作用时间(12h)后的细胞OD值为0.87±0.05,显著低于阴性对照组(作用时间Oh)(1.110±0.05)(P=0.000);200μg/ml AGEs作用时间(24h)后的细胞OD值为0.6±0.04,显著低于阴性对照组和作用12h组(P=0.000)；200μg/ml AGEs作用时间(48h)后的细胞OD值为0.3±0.04,显著低于阴性对照组和作用12h组(P=0.000),同时亦显著低于作用24h组(P<0.05)。(7)不同浓度AGEs处理24h对GLUTag细胞GLP-1分泌水平的影响100、200、300μg/ml AGEs作用GLUTag细胞24h后,细胞分泌GLP-1浓度(pmol/L)分别为69.97±4.30,55.27±6.20,37.13±5.55,均显著低于空白对照组(control)(91.27±5.23)和BSA对照组(200μg/ml BSA)(86.63±6.71)(P=0.000)。而且,200μg/ml AGEs组显著低于100μg/ml AGEs组(P=0.000),300μg/ml AGEs组显著低于100μg/ml AGEs组(P=0.000)及200μg/ml AGEs组(P<0.05)。(8)比较AGEs不同作用时间对GLUTag细胞GLP-1分泌水平的影响200μg/ml AGEs作用时间(12h)后的细胞分泌GLP-1浓度为71.10±4.75,显著低于阴性对照组(作用时间Oh)(83.97±7.28)(P=0.000);200μg/ml AGEs作用时间(24h)后的细胞分泌GLP-1浓度为55.27±6.20,显著低于阴性对照组和作用12h组(P=0.000);200μg/ml AGEs作用时间(48h)后的细胞分泌GLP-1浓度为33.93±6.01,显著低于阴性对照组和作用12h组(P=0.000),同时亦显著低于作用24h组(P<0.05)。结论：肠道L细胞株GLUTag细胞的凋亡在相同作用时间下随着AGEs的浓度增高而增多,且在相同剂量下随着AGEs的作用时间延长而增多。我们首次发现AGEs可呈剂量、时间依赖性诱导肠道L细胞凋亡,并显著降低L细胞活力以及分泌GLP-1的能力。第二部分探讨AGEs是否通过AGEs-RAGE通路对GLUTag细胞产生损伤、凋亡及其相关机制第一节AGEs对GLUTag细胞的凋亡及其相关通路的影响目的：探讨AGEs-RAGE及其下游分子信号通路在AGEs诱导的GLUTag细胞凋亡中的作用。方法：(1)实验分组：探讨不同浓度AGEs对GLUTag细胞中RAGE表达的影响时按以下分组：空白对照组,即不加入干预因素；BSA对照组;AGEs100μg/ml组;AGEs200μg/ml组；AGEs300μg/ml组,分别作用细胞24h。探讨AGEs对RAGE及其下游分子信号通路的影响时按照以下分组：空白对照组；BSA对照组；AGEs200μg/ml组;AGEs+siRNA-RAGE组：即利用siRNA-RAGE转染靶细胞后加入AGEs共培养细胞。AGEs+apocynin组：即加入AGEs和600μM的apocynin (NADPH氧化酶阻断剂)培养细胞。(2) AGEs对GLUTag细胞中RAGE表达的影响传代培养GLUTag细胞(方法同第一部分),并制备AGEs-BSA,采用已确定的AGEs浓度及时间。利用RT-PCR及Western blot检测各组细胞RAGE mRNA及RAGE蛋白表达水平。(3) AGEs对GLUTag细胞ROS水平及NADPH氧化酶亚单位表达的影响分组及培养条件同上,Western blot检测细胞中NADPH氧化酶亚单位gp22phox、p47phox的磷酸化,荧光探针检测细胞内活性氧ROS的水平。(4) AGEs对GLUTag细胞中p53、Bax因子的影响分组及培养条件同上,Western-blot法检测P53、Bax因子的变化。(5) AGEs对GLUTag细胞中caspase-3及-9的活性分组及培养条件同上,用酶联免疫法测定caspase-3及-9的活性。统计学处理：采用SPSS13.0进行统计分析,实验数据计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用单向方差分析(One-Way ANOVA)检验,两两比较采用LSD法。P<0.050具有统计学意义。结果：(1)不同浓度的AGEs对GLUTag细胞RAGE mRNA的影响100、200、300μg/ml AGEs作用GLUTag细胞24h后,RAGE mRNA表达量分别为1.45±0.13,2.14±0.010,2.45±0.32,均显著高于空白对照组(1.01±0.04)和BSA对照组(1.09±0.03)(P=0.000)。而且,200μg/ml AGEs组显著高于100μg/ml AGEs组(P=0.000),300μg/ml AGEs组显著高于AGEs组(P=0.000)及200μg/ml AGEs组(P<0.05)。(2)不同浓度的AGEs对GLUTag细胞内RAGE蛋白表达水平的影响100.200、300μg/ml AGEs作用GLUTag细胞24h后,RAGE蛋白表达水平分别为0.36±0.04,0.56±0.009,0.72±0.06,均显著高于空白对照组(0.144±0.04)和BSA对照组(0.18±0.03)(P=0.000)。而且,200μg/ml AGEs组显著高于100μg/ml AGEs组(P=0.000),300μg/ml AGEs组显著高于100μg/ml AGEs组(P=0.000)及200μg/ml AGEs组(P<0.05)。(3) AGEs对GLUTag细胞中NADPH氧化酶亚单位表达的影响各组细胞经干预24h后,200μg/ml AGEs组的gp22phox、p47phox蛋白表达水平分别为0.66±0.08,0.76±0.09,均显著高于BSA对照组(0.27±0.06,0.30±0.06)(P<0.05); AGEs+apocynin组的gp22phox、p47phox蛋白表达水平分别为0.40±±0.08,0.4±0.09,均显著高于BSA对照组(P<0.05),而且显著低于200μg/ml AGEs组(P<0.05)；AGEs+siRNA-RAGE组的gp22phox、p47phox蛋白表达水平分别为0.32±0.04,0.344±0.056,均显著低于200μg/ml AGEs组(P<0.05)。(4) AGEs对GLUTag细胞内活性氧水平的影响各组细胞经干预24h后,200μg/ml AGEs组的荧光强度为57.58±±4.69,显著高于BSA对照组(23.16±3.47)(P<0.05)；AGEs+apocynin组的荧光强度为34.97±±6.42,显著高于BSA对照组(P<0.05),而且显著低于200μg/ml AGEs组(P<0.05); AGEs+siRNA-RAGE组的荧光强度为29.444±5.27,显著低于200μg/ml AGEs组(P<0.05)。(5) AGEs对GLUTag细胞凋亡相关蛋白p53及Bax表达的影响各组细胞经干预24h后,200μg/ml AGEs组的p53蛋白表达水平为0.42±±0.05,显著低于BSA对照组(0.73±±0.05)(P<0.05),而Bax蛋白表达水平为0.66±±0.08,显著高于BSA对照组(0.27±0.08)(P<0.05)；AGEs+apocynin组和AGEs+siRNA-RAGE组的p53蛋白表达水平分别为0.644±0.05,0.71±±0.06,均显著高于200μg/ml AGEs组(P<0.05),而Bax蛋白表达水平分别为0.40±0.08,0.32±0.04,均显著低于200μg/ml AGEs组(P<0.05)。(6) AGEs对GLUTag细胞凋亡蛋白酶caspase-3及-9活性的影响各组细胞经干预24h后,200μg/ml AGEs组的caspase-3及-9活性分别为1.03±0.10,1.22±0.05,均显著高于BSA对照组(0.43±0.05,0.47±0.02)(P<0.05); AGEs+apocynin组的caspase-3及-9活性分别为0.65±0.07,0.68±0.09,均显著高于BSA对照组(P<0.05),而且显著低于200μg/ml AGEs组(P<0.05);AGEs+siRNA-RAGE组的caspase-3及-9活性分别为0.55±0.08,0.57±0.07,均显著低于200μg/ml AGEs组(P<0.05)。结论：随着AGEs干预浓度的升高,GLUTag细胞RAGE mRNA表达量和RAGE蛋白表达水平显著上升,提示AGEs可通过上调RAGE受体表达增强GLUTag细胞的氧化应激损伤。AGEs作用于GLUTag细胞24h后,NADPH氧化酶亚单位gp22phox、p47phox的表达增多,细胞内ROS水平升高,p53表达下调,Bax表达上调,凋亡蛋白酶caspase-3及-9的活性增加,细胞凋亡增加。提示NADPH氧化酶、ROS、p53/Bax及caspase-3及-9是AGEs-RAGE导致GLUTag细胞凋亡的主要下游通路。第二节AGEs对GLUTag细胞炎症损伤及p38MAPK/NF-κB通路的影响目的：观察AGEs对肠道L细胞株GLUTag细胞中炎症损伤及相关机制的影响。方法：(1)AGEs对GLUTag细胞中p38MAPK磷酸化水平的影响传代培养GLUTag细胞(方法同第一部分),并制备AGEs-BSA,采用已确定的AGEs作用时间。实验分组：空白对照组,即不加入干预因素；BSA对照组,即加入BSA培养细胞作为阳性对照；100μg/ml AGEs组,即加入100μg/ml AGEs培养细胞；200μg/ml AGEs组,即加入200μg/ml AGEs培养细胞；300μg/ml AGEs组,即加入300μg/ml AGEs培养细胞；AGEs+apocynin组：即加入AGEs和600μM的apocynin培养细胞。各组分别进行下列处理,利用Western blot检测GLUTag细胞内p38MAPK磷酸化水平。(2) AGEs对GLUTag细胞中NF-κB因子的影响分组及培养条件同上,Western blot检测NF-κB蛋白表达的变化。(3) AGEs对GLUTag细胞中炎症因子的影响分组及培养条件同上,ELISA法检测炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6的变化。统计学处理：采用SPSS13.0进行统计分析,实验数据计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用单向方差分析(One-Way ANOVA)检验,两两比较采用LSD法。P<0.050具有统计学意义。结果：(1) AGEs对GLUTag细胞中p38MAPK磷酸化水平的影响100.200、300μg/ml AGEs作用GLUTag细胞24h后,p-p38MAPK的相对表达量分别为0.41±0.05,0.61±0.05,0.82±0.04,均显著高于空白对照组(0.22±0.03)和BSA对照组(0.24±0.04)(P=0.000)。而且,200μg/ml AGEs组显著高于100μg/ml AGEs组(P=0.000),300μg/ml AGEs组显著高于100μg/mlAGEs组及200μg/ml AGEs组(P=0.000)。 AGEs+apocynin组的p-p38MAPK相对表达量为0.28±0.03,与200μg/ml AGEs组相比显著降低(P=0.000)。(2) AGEs对GLUTag细胞中NF-κB因子表达的影响100、200、300μg/ml AGEs作用GLUTag细胞24h后,NF-κB表达量分别为0.36±0.04,0.55±0.08,0.67±0.05,均显著高于空白对照组(0.18±0.02)和BSA对照组(0.20±±0.02)(P=0.000)。而且,200μg/ml AGEs组显著高于100μg/ml AGEs组(P=0.000),300μg/ml AGEs组显著高于100μg/ml AGEs组及200μg/ml AGEs组(P=0.000)。AGEs+apocynin组的NF-κB表达量为0.22±0.03,与200μg/ml AGEs组相比显著降低(P=0.000)。(3) AGEs对GLUTag细胞中炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6表达的影响100、200、300μg/ml AGEs作用GLUTag细胞24h后,TNF-α的相对含量分别为27.23±±4.25,38.93±±3.62,54.47±±5.85,均显著高于空白对照组(15.30±±1.71)和BSA对照组(16.10±±2.15)(P=0.000)。而且,200μg/ml AGEs组显著高于100μg/ml AGEs组(P=0.000),300μg/ml AGEs组显著高于100μg/ml AGEs组及200μg/ml AGEs组(P=0.000). AGEs+apocynin组的TNF-a相对含量为18.40±±3.75,与200μg/ml AGEs组相比显著降低(P=0.000)。100.200.300μg/ml AGEs作用GLUTag细胞24h后,IL-1的相对含量分别为136.50±±13.05,191.17±±12.01,287.7±±13.75,均显著高于空白对照组(50.67±4.99)和BSA对照组(55.33±6.06)(P=0.000)。而且,200μg/ml AGEs组显著高于100μg/ml AGEs组(P=0.000),300μg/ml AGEs组显著高于100μg/ml AGEs组及200μg/ml AGEs组(P=0.000)。AGEs+apocynin组的IL-1相对含量为68.17±8.72,与200μg/ml AGEs组相比显著降低(P=0.000)。100、200、300μg/ml AGEs作用GLUTag细胞24h后,IL-6的相对含量分别为95.93±12.29,177.93±9.26,234.27±19.74,均显著高于空白对照组(43.80±5.94)和BSA对照组(50.40±5.64)(P=0.000)。而且,200μg/ml AGEs组显著高于100μg/ml AGEs组(P=0.000),300μg/ml AGEs组显著高于100μg/ml AGEs组及200μg/ml AGEs组(P=0.000)。AGEs+apocynin组的IL-6相对含量为63.50±7.62,与200μg/ml AGEs组相比显著降低(P=0.000)。结论：随着AGEs浓度的增加,GLUTag细胞内p38MAPK磷酸化水平上升,NF-κB因子活化增多及炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6表达增多。利用apocynin抑制NADPH氧化酶,可调节AGEs诱导的GLUTag细胞内p38MAPK、NF-κB、TNF-α、 IL-1、IL-6等表达水平。本部分实验证明AGEs可至少部分通过激活p38MAPK/NF-κB炎症通路导致肠道L细胞的炎症损伤。