李坏死环斑病毒在欧美广泛分布，可侵染许多种重要的果树、蔬菜、花卉作物，引起严重病害甚至死亡，但在我国的存在尚无正式的报道，是我国对外检疫二类危险性生物。传统的血清学等方法存在漏检现象、假阳性、灵敏度不高等缺点、不易形成标准，不适合进出境检验检疫运用。因此建立标准、快速、准确、灵敏的方法具有重要的意义。 本文回顾了李坏死环斑病毒的检测方法，较全面地评述了国内外病原物检测技术研究进展：在模板的扩增有各种PCR技术、NASBA技术；在信号的放大有同位素、生物素或DIG标记的cDNA和cRNA探针，分支探针和肽核酸探针；模板扩增和信号放大相结合的有PCR-基因扫描技术、PCR安捷伦芯片实验室技术；模板扩增和杂交以及信号放大相结合的有PCR-ELISA技术、实时荧光PCR技术、生物芯片技术。近年来这些技术大量发展，并迅速应用到生物学各个领域。 本文根据病毒各株系外壳蛋白基因的保守序列，设计了杂交诱捕探针、Dig标记杂交探针以及确定了最佳诱捕参数和杂交检测参数，建立杂交诱捕RT-PCR—ELISA。该方法将5端氨基化的反向引物共价交链在PCR管上，在一定条件下定向诱捕核酸粗体液中的目标核酸，洗掉杂质及聚合酶抑制物质。固相引物既作为诱捕链参与核酸的诱捕，又参与PCR扩增，扩增中，在Taq酶的作用下，扩增产物沿着该引物延伸，形成一条固定在管壁上的链。对液相产物进行凝胶电泳检测的同时对固相产物进行杂交检测。该方法实现了目标核酸纯化、PCR扩增、核酸杂交以及酶联免疫检测一体化，它结合了PCR技术的高灵敏度、核酸杂交技术的特异性以及酶联免疫的信号放大作用有许多优点：1)改变核酸提取方法，利用杂交诱捕法直接从核酸粗提液中诱捕RNA，特别适合于低病毒含量、高Taq酶抑制物质的材料，减少了核酸提取的时间及试剂费用。2)结果可靠，杂交特异性诱捕目的片段，同时去除了核酸中存在的PCR抑制物质，减少了因核酸提取不纯造成的漏检现象，结果输出通过双重判定保证了结果的可靠性。3)灵敏度 －高，通过杂交进行结果判定，灵敏度比传统的 RT干CR大约高 10倍。 另外还设计了TaqMan荧光探针，确定了检测条件和参数，建立了实时荧光 RTWCR方法，该方法是指在PCR反应体系中加入带有荧光基团互补探针，如果 有PCR反应（扩增），荧光信号就较大。这样利用荧光信号积累可以实时监测整个 PCR进程，实现了PCR扩增和核酸杂交以及荧光电信号放大检测同步进行的自 动化检测技术；实时荧光PCR技术具有更大的优越性：l）不需要PCR后处理，． 可消除PCR的假阳性污染、大样品量PCR产物检测困难的问题2）操作全部由 仪器完成，实现自动化检测。3）灵敏度高，相对检测灵敏度达到0．卫W惑病组织， 绝对灵敏度为4．49Fg阳性质粒或20个左右阳性质粒分子。 我们利用建立的杂交诱捕们－PCR－ELISA和队－F－PCR对北京机场检疫局送检 的樱桃样品检出了PNRSV，同时把451hP的PCR产物克隆到Ppo18－T载体上，通 过序列测定，同源世最高的是GeneBank 中PNRSV 资料序号 gi 15750502gb山57046．18PNL57046，对它们的核酸序列相应片段比较，仅具7个 碱基突变，二者的同源性达 98％，从而确认是 PNRSV。同时该方法对番茄环斑病 毒、梨火疫细菌等对外检疫对象也能成功检测。