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布鲁氏菌(Brucela.melitensis)是革兰氏阴性菌,该病引起人和动物感染,在全世界较广泛流传,对人身安全构成威胁,给世界经济带来负担。wbkC作用于O-侧链的生物合成途径中催化GDP-4-NH2-4,6双脱氧甘露糖转换成GDP-4-甲酰胺基-4,6双脱氧甘露糖,是布鲁氏菌脂多糖O抗原合成的重要步骤。构建羊布鲁氏菌B.melitensis M5-90-△wbkC株,为研究与wbkC基因相关的microRNAs(miRNAs)奠定基础,为深入研究布鲁氏菌分子致病机制和设计更安全、更有效疫苗提供依据。本实验根据NCBI上B.melitensis M5-90基因组序列信息,查找wbkC基因序列及其上游(N)、下游(C)序列信息,查找pEGFP-N1质粒Kanar序列信息。分别设计wbkC基因N端C端同源臂和Kanar片段上下游引物。以B.melitensisM5-90基因组为模板,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction PCR)扩增wbkC基因左右同源臂序列。以pEGFP-N1质粒为模板PCR扩增Kanar序列。凝胶回收片段,分别连接至pMD20-T载体上。XbwI、KpnI酶切下N端同源臂,Kpnl、BamHI酶切下Kanar片段,BamHI、BstXI酶切下C端同源臂,回收片段。将pGEM-7ZF质粒也用相同的酶切,使产生相同的粘性末端,依次将N端同源臂、Kanar片段和C端同源臂连接pGEM-7ZF质粒,构建pGEM-7ZF-AwbkC自杀质粒,测序鉴定,将测序鉴定正确的pGEM-7ZF-△wbkC自杀质粒电转化至B.melitensis M5-90感受态细胞中,用含氨苄和卡那霉素双抗性选择培养基筛选阳性菌,菌落PCR鉴定,挑选的阳性菌培养使之同源重组,获得稳定遗传。成功构建B.melitensisM5-90-△wbkC 菌株。B.melitensis M5-90和B.melitens s M5-90-△wbkC 菌液,分别感染 RAW264.7 细胞,4 h后提取总RNA,分别进行miRNAs基因芯片分析,对B.melitensisM5-90和B.melitensis M5-90-AwbkC 在 RAW264.7 细胞差异表达 miRNAs,用 TaqMan 探针法实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)对鉴定差异表达的miRNAs,验证结果:有10 miRNAs表达上下调结果和miRNAs基因芯片的热图结果相符合,其中,mmu-miR-574-3p、mmu-miR-669c-3p、mmu-miR-669p-3p、mmu-miR-466h-5p 表达下调,mmu-miR-1949、mmu-miR-155-5p、mmu-miR-6240、mmu-miR-3473a、mmu-miR-7012-5p、mmu-miR-7024-5p表达上调。利用在线网站对△△Ct>2的5个miRNAs靶基因进行预测。