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第一章 低氧对MSC-mECM成软骨分化及其细胞肥大的影响目的:诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）在其自身分泌形成的基质（MSC-mECM）中成软骨分化,并探索低氧对其成软骨分化和其细胞肥大的影响。方法:首先用含有50μg/L抗坏血酸的培养基孵育BMSCs 10天,诱导其分泌形成细胞外基质膜（MSC-mECM）,然后经过胰酶化、离心等步骤处理后形成MSC-mECM微球。将MSC-mECM微球分成两组分别于低氧和常氧条件下成软骨分化0、7、14、21、28天。用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）、蛋白印迹（WB）和免疫组化（IHC）技术从基因和蛋白水平评估低氧对其成软骨分化和细胞肥大的影响。同时对糖胺聚糖（GAG）进行定性和定量分析,观察低氧对其生成的影响。另外,通过分别延长分化时间（至42天）和选用不同（三名）患者的BMSCs进行前述实验,明确时间和个体差异是否影响低氧对BMSCs成软骨分化和其细胞肥大的作用。各组数据采用双因素方差分析（two-way ANOVA）。结果:qRT-PCR结果显示,相比于常氧条件下,低氧从第7天起对肥大基因COL10、MMP13、ALP、RUNX2的表达表现为持续抑制作用。但低氧对成软骨基因COL2和ACAN的表达在不同的时间作用不一样。然而在蛋白水平上,WB和IHC结果均显示,从第14天开始,低氧能持续抑制ACAN和COL2的表达。低氧对于RUNX2、ALP、COL10和MMP13的影响,WB和IHC结果与PCR结果一致,从第7天起显示持续地抑制作用。此外WB也显示,相比于常氧,低氧能降低β-Catenin、胰岛素样生长因子-1（IGF1）、IGF1受体（IGF1R）、SMAD1/5（一转录激活因子）的生成。GAG定量分析证实低氧在第7天（P=0.0068）、第14天（P=0.0108）、第21天（P=0.0108）、第28天（P=0.0031）均能持续抑制GAG在基质中的沉积。最后,蛋白水平上,低氧除了对软骨基质蛋白COL2的生成在抑制程度上存在着个体差异外,对细胞肥大的抑制作用和程度无明显个体差异。分化时间不会改变低氧对BMSCs成软骨分化和细胞肥大的抑制作用。结论:低氧不仅抑制BMSCs软骨分化过程中的细胞肥大,也抑制其软骨基质蛋白的生成。第二章 低氧抑制MSC-mECM成软骨分化及其细胞肥大的机制目的:明确低氧是否通过下调Wnt/β-Catenin、IGF1/IGF1R信号抑制MSC-mECM微球的成软骨分化和其细胞肥大。其次,在不明显促进细胞肥大的前提下,能否通过调控β-Catenin或IGF1改善低氧引起的低软骨分化,为透明样软骨再生提供新的可能途径。方法:1、明确低氧是否通过下调Wnt/β-Catenin抑制MSCmECM微球的软骨形成及其细胞肥大。首先将MSC-mECM微球分成两组分别于低氧和常氧条件下成软骨分化14天,随后各组再分为两个亚组,在不同条件下继续培养14天:a)常氧组（Nor group）:MSC-mECM微球在常氧条件下成软骨分化,分化培养基中加入二甲基亚砜（DMSO）和磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液）作为空白对照干预。b)常氧+IWP2组（Nor+IWP2 group）:MSCmECM微球在常氧条件下成软骨分化,培养基中加入2μM IWP2和PBS溶液,抑制Wnt/β-Catenin信号。c)低氧组（Hypo group）:MSC-mECM微球在低氧条件下成软骨分化,培养基中加入DMSO和PBS溶液作为空白对照干预。d)低氧+Wnt3a组（Hypo+Wnt3a group）:MSC-mECM微球在低氧条件下成软骨分化,培养基中加入100ng/ml Wnt3a和DMSO,激活Wnt/β-Catenin信号。用前述方法评估其对MSCs成软骨、细胞肥大和GAG沉积的影响。2、从两个方面明确低氧是否通过下调IGF1/IGF1R信号抑制MSC-mECM微球软骨形成及其细胞肥大。一方面用干扰RNA敲降IGF1R,通过抑制IGF1/IGF1R信号明确其具体作用。即将MSC-mECM分成两组,一组用干扰RNA敲降其IGF1R,一组用Scrambled干扰RNA感染作为空白对照组,48h后经胰酶、离心处理形成微球,使其在常氧条件下成软骨分化24h后,用WB检测其对成软骨分化的作用。另一方面在低氧和常氧条件下均用100ng/ml IGF1激活IGF1/IGF1R信号进一步明确其具体作用。首先将MSC-mECM微球分成两组分别于低氧和常氧条件下成软骨分化14天,随后各组再分为两个亚组,在不同条件下继续培养14天:a)常氧组（Nor group）:MSC-mECM微球在常氧条件下成软骨分化,分化培养基中加入PBS溶液作为空白对照干预。b)常氧+IGF1组（Nor+IGF1group）:MSC-mECM微球在常氧条件下成软骨分化,培养基中加入100ng/ml IGF1。c)低氧组（Hypo group）:MSC-mECM微球在低氧条件下成软骨分化,培养基中加入PBS溶液作为空白对照干预。d)低氧+IGF1组（Hypo+IGF1 group）:MSC-mECM微球在低氧条件下成软骨分化,培养基中加入100ng/ml IGF1。用qRTPCR、WB、组织学染色和IHC、GAG定量分析评估各组MSCmECM微球成软骨分化、细胞肥大和GAG沉积的情况。最后,选用不同（三名）患者的BMSCs重复该实验,观察不同个体对IGF1的刺激作用是否存在差异。各组数据采用单因素方差分析（oneway ANOVA）。结果:1、qRT-PCR结果显示,Nor+IWP2 group相比于Nor group,能显著下调ACAN（P=0.0018）、COL2（P=0.0086）、COL10（P=0.0040）、ALP（P=0.0031）基因的转录。Hypo+Wnt3a group相比于Hypo group能明显促进RUNX2（P=0.0302）、ALP（P=0.0495）基因的表达。在蛋白水平上,WB和IHC结果均显示Nor+IWP2 group相比于Nor group,能够降低软骨特异性基质蛋白和肥大因子的生成。反之,Hypo+Wnt3a group相比于Hypo group能上调软骨基质蛋白与肥大蛋白的表达。GAG定量分析证实,Wnt3a能显著促进GAG的累积（P=0.0135）,而IWP2则减少其产生（P=0.054）。2、常氧条件下干扰RNA敲降IGF1R后能抑制软骨基质蛋白COL2和ACAN的生成,且下调肥大标志蛋白COL10和ALP的表达。外源性添加IGF1后,qRT-PCR结果显示,Nor+IGF1 Group相比于Nor Group能显著上调COL10（P=0.0383）和ALP（P=0.0258）的表达,Hypo+IGF1 Group相比于Hypo Group也能显著提高COL10（P=0.0089）的转录。WB和IHC结果证实无论是常氧还是低氧条件下,外源性添加IGF1均显著上调基质蛋白COL2、ACAN的生成,而对肥大因子COL10、MMP13、RUNX2、ALP的生成仅有微弱促进作用。GAG定量分析显示IGF1既能促进常氧中GAG的累积（P=0.1117）,也能明显改善低氧引起的GAG减少（P=0.0479）。最后WB结果显示,无论是常氧还是低氧条件下,IGF1对不同个体来源的BMSCs其成软骨分化均有刺激作用,但在程度上存在着个体差异。结论:低氧通过下调Wnt/β-Catenin信号同时抑制MSC-mECM的成软骨分化和其细胞肥大;而低氧通过下调IGF1/IGF1R信号主要是抑制MSC-mECM的成软骨分化。低氧条件下通过激活IGF1/IGF1R信号可诱导MSC-mECM形成透明样软骨,而通过调控Wnt/β-Catenin信号没有该效果。第三章 低氧联合IGF1诱导MSC-mECM成软骨分化的机制目的:明确ERK1/2、AKT是否介导低氧联合IGF1对MSCmECM成软骨分化的诱导作用。方法:首先,将MSC-mECM微球分成两组分别在常氧与低氧条件下成软骨分化28天,WB分析低氧对ERK1/2、AKT磷酸化水平的作用。其次,在常氧和低氧条件下,分别用100ng/ml IGF1诱导MSC-mECM微球成软骨分化,WB评估IGF1对ERK1/2、AKT磷酸化水平的影响。最后,将MSC-mECM微球分成两组分别于低氧和常氧条件下成软骨分化14天,随后低氧组再分为三个亚组,在不同条件下继续培养14天:a)常氧组（Nor group）:MSCmECM微球在常氧条件下成软骨分化,分化培养基中加入DMSO和PBS溶液作为空白对照干预。b)低氧组（Hypo group）:MSCmECM微球在低氧条件下成软骨分化,培养基中加入DMSO和PBS溶液作为空白对照干预。c)低氧+IGF1组（Hypo+IGF1group）:MSC-mECM微球在低氧条件下成软骨分化,培养基中加入100ng/ml IGF1和DMSO。d)低氧+IGF1+U0126组（Hypo+IGF1+U0126 group）:MSC-mECM微球在低氧条件下成软骨分化,培养基中加入100ng/ml IGF1和5μM U0126,在IGF1通路激活的情况下,用U0126（5μM）阻断ERK1/2信号。用前述实验方法评估抑制ERK1/2信号是否削弱IGF1对BMSCs成软骨分化、细胞肥大和GAG沉积的影响。各组数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。结果:WB结果显示低氧能降低p-ERK1/2的表达,其趋势与低氧对IGF1的作用一致。而低氧对AKT没有该效应。同时WB结果也显示IGF1能促进ERK1/2而不是AKT的磷酸化。在阻断ERK1/2信号的实验中,qRT-PCR结果显示,Hypo+IGF1+U0126group相比于Hypo+IGF1 group其COL10基因（P＜0.0001）的表达显著降低。WB和IHC结果证实Hypo+IGF1+U0126 group相比于Hypo+IGF1 group其软骨基质蛋白（ACAN、COL2）和细胞肥大相关标志因子（COL10、MMP13、RUNX2、ALP）的生成减少。GAG定量分析证实中断ERK1/2信号后IGF1对GAG生成的促进作用则消失（P＜0.0001）。结论:ERK1/2而不是AKT介导低氧联合IGF1对MSCmECM微球成软骨分化的诱导作用。第四章 基于低氧联合IGF1分化的MSC-mECM微球修复软骨缺损的作用研究目的:明确基于低氧条件下IGF-1成软骨诱导的MSC-mECM微球是否能在体内形成透明软骨样组织从而修复软骨缺损。方法:将10周龄免疫缺陷型大鼠（250-350g）随机分成4组（每组3只）:a)空白对照组（Con group）:对双侧后肢膝关节股骨髁行软骨缺损造模（2mm×2mm）,缺损处未植入任何材料;b)常氧组（Nor group）:对双侧后肢膝关节股骨髁行软骨缺损造模（2mm×2mm）,缺损处植入常氧条件下成软骨分化2周的MSC-mECM微球。c)低氧组（Hypo group）:对双侧后肢膝关节股骨髁行软骨缺损造模（2mm×2mm）,缺损处植入低氧条件下成软骨分化2周的MSC-mECM微球。d)低氧+IGF1组（Hypo+IGF1 group）:对双侧后肢膝关节股骨髁行软骨缺损造模（2mm×2mm）,缺损处植入低氧联合IGF1成软骨分化2周的MSC-mECM微球。8周后从肉眼大体观和组织学染色评估各组修复效果。各组数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。结果:肉眼大体观和组织学染色显示,Con group修复的软骨其表面粗糙,与周边软骨接合处可见血管生成,基质中没有GAG生成;Hypo group中MSC-mECM微球修复的软骨表面虽光滑,但与周边软骨接合较差,基质中GAG沉积比较疏松;Nor group和Hypo+IGF-1 group无明显差异,修复的软骨表面光滑,与周围软骨接合较好,基质中生成致密的GAG。IHC染色及定量分析显示,Con group相比于Nor group,其COL1的表达增多但两组无统计学差异;基质蛋白ACAN（P＜0.0001）和COL2（P＜0.0001）的生成显著降低,甚至比Hypo group还低;肥大因子COL10（P=0.0011）和成骨因子ALP（P=0.0007）的表达明显增高。Hypo group相比于Nor group,纤维化因子COL1的表达虽减少但两者间无统计学差异;基质蛋白ACAN（P＜0.0001）和COL2（P＜0.0001）的生成显著减少;肥大和成骨因子COL10（P=0.0037）、MMP13（P＜0.0001）、ALP（P＜0.0001）的生成显著降低。相比于Hypo group,Hypo+IGF1 group生成的ACAN（P=0.0006）和COL2（P＜0.0001）显著增加,且与Nor group相比无统计学差异;COL1（P=0.0003）表达显著降低;Hypo+IGF1 group中肥大因子COL10、MMP13、ALP虽有上升,但两组之间无统计学差异。结论:低氧联合IGF-1成软骨分化的MSC-mECM微球植入体内后能形成透明软骨样组织从而修复软骨缺损。