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植物蛋白质经蛋白酶部分水解后,可获得具有生物活性的多肽诸如抗氧化、降血糖、抗肿瘤、抗高血压、活化细胞免疫机能等多肽,是现代食品和医药领域最热门的研究方向,也是提升植物蛋白利用价值的主要途径。来自各种植物的肽是潜在的抗氧化剂,如棉籽蛋白,乳清蛋白,大豆蛋白等水解多肽,抗氧化肽通过清除自由基等来发挥其能力。目前国内对于亚麻的研究主要集中在亚麻油脂的开发利用,而对于亚麻蛋白质的研究关注较少。我们以亚麻籽粕为原料进行抗氧化肽的制备,比较了不同酸性蛋白酶和中性蛋白酶酶解多肽的得率及多肽的抗氧化能力,结果表明:3.350黑曲酸性蛋白酶的酶解效果最好,多肽得率可达28.52%。通过蛋白酶的单因素和正交实验,确定亚麻多肽制备的最佳工艺条件为:酶解温度60℃、pH2.7、加酶量6500U/g、酶解时间2.5h,此条件下亚麻多肽得率为38.80%。凝胶色谱分析表明,该酶多肽的分子量主要分布在1000Da7600Da范围内。酶解后的亚麻多肽具有良好的抗氧化能力,当酶解液质量浓度为1.5mg/ml时,DPPH自由基清除率为89.99%,当酶解液质量浓度为0.6mg/ml时,超氧阴离子的清除率为85.57%。糖尿病是人们公认的危害健康的顽疾之一,控制人体肠道中α-葡萄糖苷酶的活性是治疗糖尿病症状的有效方法之一。本实验室前期研究揭示亚麻胰蛋白酶抑制剂（Linum usitatissimum L.LUTI）是亚麻中一种兼具胰蛋白酶抑制剂和α﹣葡萄糖苷酶抑制剂双重活性的多肽。为了进一步研究亚麻双功能多肽的分子结构和抑制糖苷酶和胰蛋白酶活性的构效关系,我们化学合成亚麻双功能多肽基因,并克隆到pGEX-6p-1载体在大肠杆菌BL21中进行重组表达,获得可溶性蛋白GST-LINUS-TI,经GST-Prescission Protease切割后经GST-Spharose4B亲和柱和Sephacryl S-200凝胶柱纯化获得电泳纯的rLUTI,并分析rLUTI对双酶抑制活性,发现rLUTI对两种酶的抑制活性明显高于天然LUTI。利用α-糖苷酶酶活性测定以及凝胶过滤色谱和动态光散射（DLS）,分析了亚麻胰蛋白酶抑制剂（LINUS-TI）和α-葡萄糖苷酶之间的关系,进一步证实LINUS-TI不仅能抑制抑制α-葡萄糖苷酶的活性,也可以在LINUS-TI和α-葡萄糖苷酶之间会形成复合物。利用基因定点突变获得rLUTI的T44/A和K45/A突变体,通过对突变体的抑制活性测定,发现它们对α-葡萄糖苷酶抑制活性显著下降,对胰蛋白酶抑制活性高于天然LUTI,对胰蛋白酶抑制活性低于rLUTI。利用ZDOCK服务器进行LINUS-TI和α-葡萄糖苷酶之间的分子对接,发现α-葡萄糖苷酶的12个氨基酸残基（Phe384,Asp392,Lys439,Asp568,Glu707,Asn708,Glu771,Asn772,Ser774,Gly780,Thr781,Glu784）与LINUS-TI的6个氨基酸残基（Ser1,Arg2,Arg3,Asp46,Phe47,Arg48）通过14个氢键（H键）形成界面相互作用。为验证分子对接结果,将LUTI基因及其点突变或缺失突变体基因连接到pET-3a载体上获得重组载体pET-3a-LUTI,转化至大肠杆菌菌株E.coliBL21（DE3）表达经Q-Sepharose离子交换柱和Superdex75凝胶柱纯化获得电泳纯的野生型LUTI（rLUTI）及其突变体D46/A、F47/A、R48/A和缺失体rLUTI（2-69）、rLUTI（3-69）、rLUTI（4-69）、rLUTI（5-69）的蛋白样品。通过对缺失体和突变体的抑制活性测定,研究发现rLUTI的缺失体rLUTI（2-69）、rLUTI（3-69）、rLUTI（4-69）、rLUTI（5-69）对α-葡萄糖苷酶的抑制活性影响明显下降,胰蛋白酶抑制活性略微上升,rLUTI的D46/A,F47/A,R48/A突变体对α-葡萄糖苷酶的抑制活性影响明显下降,但丧失了对胰蛋白酶的抑制活性。以上结论结论表明亚麻胰蛋白酶抑制剂中N端SXXXP[1-5]氨基酸序列在维持其双酶抑制活性上发挥着重要作用,特别在α-葡萄糖苷酶抑制活性方面尤为突出,rLUTI第44、45、46、47和48位氨基酸在抑制α-葡萄糖苷酶以及胰蛋白酶活性中的各自发挥的作用存在明显的差异,其中44和45位氨基酸是影响α-葡萄糖苷酶抑制活性的结构位点,46、47和48位氨基酸是影响胰蛋白酶抑制活性的结构位点。